β-1,3-葡聚糖酶的結構與催化性質研究進展

王 瑞,楊 君,楊 青(大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

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β-1,3-葡聚糖酶的結構與催化性質研究進展

王 瑞,楊 君*,楊 青
(大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

β-1,3-葡聚糖酶廣泛存在于細菌、真菌、植物和無脊椎動物中,因來源的差異,β-1,3葡聚糖酶的生理功能多樣,如參與植物生長發育、提高或誘導抗病性、提供菌體營養、調節真菌細胞壁穩定性和剛性、參與病毒釋放和入侵等。酶的結構研究是探索酶催化反應機理、挖掘酶催化特性以及酶理性設計改造的基礎。本文對晶體結構研究最充分的GH16家族細菌β-1,3-葡聚糖酶的結構特征及催化機理進行綜述,并通過與GH17家族植物來源β-1,3-葡聚糖酶的結構比較,揭示細菌β-1,3-葡聚糖酶的作用機制,為進一步改造和利用該酶,實現其在植物保護、食品和制藥等領域的應用提供重要參考。

β-1,3-葡聚糖酶,晶體結構,催化機制,底物特異性

β-1,3-葡聚糖酶是一類能夠水解以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖的酶系,廣泛存在于細菌、真菌、植物和無脊椎動物中。自發現自然界生物體內存在β-1,3-葡聚糖酶以來,人們長期不懈地對其進行研究,研究內容涵蓋β-1,3-葡聚糖酶的分離純化、生理生化特性、在生物體內的作用、編碼β-1,3-葡聚糖酶的基因等。目前,對β-1,3-葡聚糖酶的應用研究多集中于工業廢料的綜合利用、精益啤酒和葡萄酒釀造工程中酒的過濾工藝且抑制潛在真菌的污染[1]、飼料添加劑[2-3]、活性多糖的改性增溶[4-5]、果蔬的綠色保鮮[6]、植物病害防治[7]與真菌細胞壁結構分析[8]等。

目前為止,CAZY數據庫共收集8個來源于細菌和4個來源于植物的β-1,3-葡聚糖酶晶體結構(http://www.cazy.org/)。這兩個來源不同的酶能夠催化相同的底物,但二者無論在氨基酸序列上還是在三維空間結構上都沒有相似性。植物β-1,3-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶17家族,擁有一個(β/a)8桶狀結構,而細菌β-1,3-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶16家族,其三級結構為典型的“β-jelly-roll”結構,表面形成凹槽結構,易于和底物結合。此外,由于大部分細菌本身不含有β-1,3-葡聚糖,β-1,3-葡聚糖酶的主要功能是分解周圍環境中的葡聚糖,起到營養作用[9],因而細菌β-1,3-葡聚糖酶可能具有更為廣泛的底物譜。因此,本文對GH16家族細菌β-1,3-葡聚糖酶的結構特征及催化機理進行綜述,并通過與GH17家族植物來源β-1,3-葡聚糖酶的結構比較,理解細菌β-1,3-葡聚糖酶的作用機制,為進一步改造和利用該酶,實現其在食品、制藥和植保等領域的應用提供重要參考。

1 細菌β-1,3-葡聚糖酶的結構特征和水解機制

1.1 細菌β-1,3-葡聚糖酶的序列特征

目前,人們已經分離得到了許多細菌β-1,3-葡聚糖酶,這些物種包括環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)[10]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[11]、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)[12]、鹽屋鏈霉菌(Streptomycessioyaensis)[13]以及諾卡土壤菌F96(Nocardiopsissp. F96)[14]等。以海棲熱袍菌MSB8(ThermotogamaritimaMSB8)β-1,3-葡聚糖酶催化域的結構(3AZX)[15]為模板,利用MEGA5.1與來源于嗜堿性的諾卡土壤菌F96(alkaliphilicNocardiopsissp. strain F96)的內切β-1,3-葡聚糖酶(2HYK)[16]、來源于嗜熱古細菌(Pyrococcusfuriosus)的內切β-1,3-葡聚糖酶(2VY0)、來源于鹽屋鏈霉菌(Streptomycessioyaensis)的內切β-1,3-葡聚糖酶(3DGT)[13]、來源于海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)的β-1,3-葡聚糖酶(3ILN)、來源于結合分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的β-1,3-葡聚糖酶(4WZF)[17]、來源于海洋細菌Zobelliagalactanivorans的β-1,3-葡聚糖酶ZgLamA(4BOW)[18]和ZgLamC(4CRQ)[19]以及來源于熱袍菌Thermotogapetrophila的內切β-1,3-葡聚糖酶(4DFS)[20]進行序列比對,并將結果經ESPript 3.0修飾。基于結構的序列分析表明,這些來源于不同細菌的酶具有相似的二級結構,其中包括β-鏈和α螺旋的數目和長度。以ThermotogamaritimaMSB8海帶多糖酶(Laminarinase)為例,該酶催化域的二級結構包含18個β-鏈(形成2個扭曲的β折疊片)、2個短α-螺旋以及2個310螺旋。序列對比的結果表明,除了與同樣來源于熱袍菌屬的Thermotogapetrophilaendo-β-1,3-glucanase的序列一致性達到99%之外,TmLamCD與其它蛋白之間的序列一致性只有28%～50%左右(圖1)。盡管GH16家族β-1,3-葡聚糖酶彼此之間的同源性不高,但這些酶的折疊方式和某些氨基酸殘基卻高度保守,尤其是該家族特征性的EIDIXE序列在酶的催化作用中發揮著非常重要的作用,其中靠前的Glu通常在催化過程中作為親核試劑,而靠后的Glu則是催化酸/堿。

1.2 細菌β-1,3-葡聚糖酶的整體結構

為了表現GH16家族細菌來源的β-1,3-葡聚糖酶之間結構的異同,本文將PDB數據庫中已知結構的酶(包括2HYK、3AZX、3DGT、3ILN、4BOW、4CRQ、4DFS以及4WZF)催化域部分重疊,得到圖2(A)的結果。細菌β-1,3-葡聚糖酶富含β-折疊,這些鏈彎曲折疊成兩個面對面反向平行的片層結構,形成典型的類似三明治的“β-jelly roll”結構,并呈現出一定的彎曲以形成一個供底物結合的凹槽(圖2B)。催化域結構非常保守,其中兩個反向平行的折疊片的結構尤為保守,每條β-鏈的長度和彎曲走向都基本保持一致。同時,在已知結構的β-1,3-葡聚糖酶中都發現一個與酶結合的Ca2+,這一現象在GH16家族糖苷水解酶中也是非常保守的[21]。該鈣離子在細菌葡聚糖酶中可能起到提升熱穩定性的作用[22]。根據晶體結構,鈣離子位于酶催化凹槽的背面,而底物則與酶沿著凹槽相互結合,二者的空間距離較遠,說明鈣離子對酶的催化作用沒有直接影響[15]。鈣離子的結合位點也非常一致,都是由兩個氨基酸序列相距較近的Glu和Gly以及一個距離較遠的Asp的骨架羰基氧和Asp的羰基側鏈氧與鈣離子相互作用,從而使鈣離子穩定結合。

圖2 細菌β-1,3-葡聚糖酶的整體結構[13,15-20,23-24]Fig.2 The overall structure of bacterial β-1,3-glucanase[13,15-20,23-24]注:A. GH16家族已知晶體結構的所有細菌 β-1,3-葡聚糖酶三維結構疊加對比; B.來源于Zobellia galactanivorans的β-1,3-葡聚糖酶 ZgLamA與一個海帶四糖的復合物晶體結構。

1.3 催化域的活性位點

細菌β-1,3-葡聚糖酶的活性位點包括作為親核試劑、催化酸/堿的催化關鍵殘基和一系列為底物結合和穩定過渡態提供結構和功能支撐的輔助殘基。研究發現細菌β-1,3-葡聚糖酶的催化活性依賴于位于一個高度保守單元(EXDXXE)的2個谷氨酸殘基和1個天冬氨酸殘基[25]。Wen-Yih Jeng等[15]用環狀的己糖類似物葡糖酸內脂與TmLamCD共結晶并得到復合物晶體結構揭示在催化位點周圍的氨基酸殘基中,Asn-45、Glu-132、Glu-137和His-151與葡萄糖酸內酯形成了直接的氫鍵,Oδ2原子與His-151的Nε2形成氫鍵的Asp-134也參與了穩定配體,同時Trp-116殘基和Ala114殘基與底物形成了疏水作用力。為了模擬長鏈底物在TmLamCD中的位置,他們又用一種具有一個極性頭部和16個C尾部的表面活性劑分子CTAB與酶進行了共結晶,發現Ile-40、Trp-43、Asn-45、Arg-85、Ala-114、Trp-116、Trp-127、Glu-132和Glu-137等殘基都與CTAB分子形成了疏水作用。

圖1 GH16家族β-1,3-葡聚糖酶以結構為基礎的序列對比Fig.1 Structure-based sequence alignment of family GH16 β-1,3-glucanase

1.4 水解機制

糖苷水解酶的水解機制主要分為反向水解機制(inverting mechanisms)和保留水解機制(retaining mechanisms),而GH16家族的糖苷水解酶所采取的水解機制是保留水解機制[26]。該家族酶的整個催化過程分為兩個步驟。首先,Glu-132作為親核試劑攻擊糖環上的C1原子從而使兩個糖環之間的β-1,3-糖苷鍵斷裂。然后Glu-137作為催化酸接受電子,進而將電子轉移給鄰近的水分子,接著該水分子攻擊之前β位置的C1原子,最終Glu-132和產物得以釋放(圖3)。

2 細菌β-1,3-葡聚糖酶的底物特異性

雖然同屬一個糖苷水解酶家族,且結構相似,但GH16家族β-1,3-葡聚糖酶相互之間具有不同的底物特異性。根據Aurore Labourel等人的研究,來源于海洋細菌Zobelliagalactanivorans的β-1,3-葡聚糖酶ZgLamA對底物β-1,3-葡聚糖海帶多糖(laminarin)的催化效率要比對混合鏈葡聚糖MLG(β-1,3-1,4-葡聚糖)高將近22倍左右。對比ZgLamA與兩種底物的復合物晶體發現,酶與兩種底物的相互作用在底物結合位點-1和-2位置非常相似(圖4A和B),兩個糖殘基分別與酶的Glu-274、Trp-238、Asp-271、Glu-250、Arg-213、Asn-171和Ser-269等氨基酸殘基形成氫鍵,同時還與Trp-238、Trp-242、Trp-264以及His-170等氨基酸殘基形成疏水作用。因為MLG中β-1,4-糖苷鍵的存在,使得其在底物結合位點-3位置的糖殘基相較于海帶六塘發生了180°的翻轉,最終導致Glu-263代替Trp-264與糖殘基形成氫鍵。

圖3 β-1,3-葡聚糖酶的保留催化機制[26]Fig.3 The retaining mechanisms of β-1,3-glucanase[26]

圖4 細菌β-1,3-葡聚糖酶的底物特異性[17-19]Fig.4 The substrate specificity of bacterial β-1,3-glucanases[17-19]注:A和B,ZgLamA催化凹槽分別與海帶四糖(A)和G3G4G(B)的相互作用;C,ZgLamA與海帶四糖復合物晶體結構的 卡通模型和疏水表面(圖中深灰色部位為ZgLamA特有的環結構);D,ZgLamC晶體結構的 卡通模型和疏水表面;E,Rv0315晶體結構的卡通模型和疏水表面。

從晶體結構圖中可以看出(圖4A和B),海帶己糖由于β-1,3-糖苷鍵的不斷延伸使其在催化凹槽中呈現出螺旋型構象,而混合鏈的G3G4G則由于β-1,4-糖苷鍵的出現使其表現出直線型構象。通過二級序列對比發現,ZgLamA擁有一個由17個氨基酸(從Ala-246到Ala-262)組成的長環(loop)(圖4C),而這個環結構在其他同家族已知結構的β-1,3-葡聚糖酶中是不存在的。該環結構存在于催化凹槽中,堵塞了酶的負結合位點從而使ZgLamA的催化中心呈現出彎曲凹槽的構象(圖4C)。這種構象非常有利于酶結合具有螺旋型構象的β-1,3-葡聚糖,同時妨礙直線型的混合鏈葡聚糖的結合。這也解釋了ZgLamA對β-1,3-葡聚糖的催化效率遠高于對MLG的催化效率的原因。

隨后,Aurore Labourel等人得到了同樣來源于海洋細菌Zobelliagalactanivorans且與ZgLamA同源性為37%的另一個GH16家族β-1,3-葡聚糖酶ZgLamC的晶體結構。ZgLamC同樣既可以水解β-1,3-葡聚糖海帶多糖又可以水解混合鏈葡聚糖MLG,但與ZgLamA不同的是,它對海帶多糖的催化效率比對MLG的催化效率高3倍。對比二者總體的晶體結構發現,因為缺少ZgLamA特有的環結構,ZgLamC的催化中心呈現出直線型的凹槽(圖4D)。Aurore Labourel等人對比了這兩種酶與底物復合物晶體的區別,發現底物結合位點-1和-2位置的糖殘基與酶的相互作用基本相同,相關氨基酸殘基也很保守。但是-3位置因為沒有環的堵塞,從而使ZgLamC具有一個相對大的空間來結合海帶多糖和MLG兩種底物。這解釋了ZgLamC對兩種底物催化效率相差不大的原因。

Wanyu Dong等人[17]得到了結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)來源的β-1,3-葡聚糖酶Rv0315的晶體結構。與前兩個酶不同的是,Rv0315不管在何種pH條件下,都不具備水解海帶多糖的能力,即使增加酶濃度也檢測不到任何活力。為了找到Rv0315沒有水解活力的原因,Wanyu Dong等人對比了其與ZgLamA結構的差異。相比之下,兩個酶的總體結構是非常相似的,但Rv0315具有一個更大的催化凹槽(圖4E),進一步對比二者與底物復合物晶體之間的差異,發現在底物結合位點-1處,Rv0315和ZgLamA與底物的結合非常相似,但Rv0315缺失了所有在ZgLamA中與-2和-3位置的糖殘基相互作用的氨基酸殘基,例如Asn-171、Glu-250、Arg-213、Trp-264和His-170等,并因此導致Rv0315的催化凹槽的尺寸明顯偏大,這可能是Rv0315沒有明顯催化活性的原因。

綜上所述,雖然GH16家族β-1,3-葡聚糖酶的結構總體上非常相似,但是酶與底物結合殘基的差異,仍會影響酶對不同類型底物的選擇性和催化活性,這使得細菌β-1,3-葡聚糖酶的底物譜具有多樣性。

3 細菌β-1,3-葡聚糖酶與植物β-1,3-葡聚糖酶結構對比

植物β-1,3-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶17家族,其結構特征是擁有一個(β/α)8TIM桶狀結構。迄今為止,人們已經得到4個植物β-1,3-葡聚糖酶的晶體結構(http://www.cazy.org/)。序列對比分析結果表明,桶狀結構核心區域的β-鏈是高度保守的,主要的差異都發生在蛋白外圍的環結構和螺旋結構處,而且都是由于序列的插入或者刪除引起的。2013年,Agnieszka Wojtkowiak等人獲得了馬鈴薯內切-β-1,3-葡聚糖酶(GLUB20-2)突變體E259A與一個海帶六糖共結晶的晶體結構,這是人們首個得到的GH17家族糖苷水解酶與寡糖分子的復合晶體結構。雖然將其活性位點突變,但GLUB20-2E259A仍具有剩余活性,質譜分析揭示該突變體用兩種方式切割了海帶六糖,分別產生了一個海帶三糖分子和一個海帶四糖分子[27](圖5A、B)。

結構顯示三糖分子被固定在酶的底物結合位點-1、-2和-3處,具有較高的結合親和力,其非還原端位于催化凹槽的遠端。其中,底物兩個糖分子與-1和-2的結合高度保守,且與參與水解活性的關鍵殘基Asn117、Glu310、Lys313和Glu319有相互作用,共形成8個直接的氫鍵和2個水分子介導的氫鍵[28]。此外,Tyr58的芳香環與-2位的糖形成疏水作用,而Phe305和Phe322的芳香環則與-1位的糖相互作用。底物結合位點-3處的糖與Gln82形成兩個直接的氫鍵及水分子介導的氫鍵,以穩固三糖分子與酶的結合。除可結合三糖分子外,酶的催化凹槽也可容納一個海帶四糖,但由于在+1和+2結合位點底物與酶的低親和力導致電子云混亂,該研究未能解析出對應的葡萄糖分子(如圖5A、B)。盡管如此,+1位置的糖很可能會與Phe204形成疏水相互作用,而+3和+4底物結合位點處的糖可與Thr166形成直接的氫鍵。

GLUB20-2催化凹槽形成兩端開口中間彎曲的峽谷型幾何構象。該構象排除了任何直線型β-1,4-葡聚糖在-3到+4底物結合位點結合的可能性,而針對β-1,6-糖苷鍵,該酶也僅可能提供+1和+2結合位點。這也解釋了植物β-1,3-葡聚糖酶主要水解由β-1,3-糖苷鍵相連的葡聚糖分子[29],而對混合鏈的β-1,3-1,4-葡聚糖[30]和具有分支的β-1,3-1,6-葡聚糖[31]僅有非常有限的催化活性。

植物β-1,3-葡聚糖酶與細菌β-1,3-葡聚糖酶采用相同的水解機制(retaining mechanism)來催化以β-1,3-糖苷鍵相連的葡聚糖分子的水解。二者在催化過程中作為質子供體和親核試劑的都是兩個嚴格保守的谷氨酸殘基。但是,二者在序列和蛋白結構上有著巨大的差異。序列比對發現,植物β-1,3-葡聚糖酶中,參與催化的兩個谷氨酸殘基分別位于相距較遠的兩個β-鏈的末端,而細菌酶中相應的兩個谷氨酸殘基則處于同一條β-鏈上,彼此之間只有5個氨基酸殘基的距離。以底物分子為基準,將馬鈴薯β-1,3-葡聚糖酶(StLam)與底物的復合物晶體結構和海洋細菌Zobelliagalactanivoransβ-1,3-葡聚糖酶(ZgLamA)與底物的復合物晶體結構進行對接(圖5C)發現,兩個酶重合部分較少,植物酶與細菌酶的催化凹槽差異較大且底物在催化凹槽中的結合方向也不同(圖4和圖5)。植物酶體積要大于細菌酶,催化凹槽更長且具有獨特的幾何構象,而細菌酶的催化凹槽中底物結合位點少于植物酶,并且絕大多數呈現兩端開口的直線型構象,這使得植物酶相比于細菌酶具有更突出的底物專一性。

圖5 植物β-1,3-葡聚糖酶的結構及其與細菌β-1,3-葡聚糖酶結構的對比[18]Fig.5 Three-dimensional structure of plant β-1,3-glucanase and structural comparison of plant β-1,3-glucanase and bacterial β-1,3-glucanase[18]注:A.StLam晶體結構的卡通模型;B.StLam與底物復合物晶體的疏水表面模型; C.ZgLamA和StLam分別與底物的復合物晶體結構以底物分子為基準對接(圖中ZgLamA為白色,StLam為黑色)。

4 展望

酶結構與功能的研究是探索酶催化反應機理、挖掘酶催化特性以及酶理性設計改造的重要基礎。β-1,3-葡聚糖酶因其特異性水解β-1,3-葡聚糖的能力,在食品工業和植物保護研究中受到廣泛關注。但一些新型β-1,3-葡聚糖酶(如GH64、GH81、GH128及GH132家族)因缺乏晶體結構信息,其催化機制和底物選擇性的分子機制尚不清楚,限制了酶的工程化改造和工業化應用。本研究通過對細菌β-1,3-葡聚糖酶結構和催化性質的總結和分析,有助于理解該酶所呈現的底物選擇和催化活性多樣性的分子基礎,使我們可以基于比較結構生物化學,調控或改造β-1,3-葡聚糖酶的性質,以實現其在水果保鮮、植物抗病及活性小分子多糖制備等多領域的應用。

[1]Jadhav SB,Gupta A. Studies on application ofβ-1,3 glucanase in the degradation of glucans produced by Botrytis cinerea and inhibition of fungal growth[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2016,7:45-47.

[2]Bl?ttel V,Larisika M,Pfeiffer P.β-1,3-Glucanase from Delftia tsuruhatensis strain MV01 and its potential application in vinification[J]. Applied and Environmental Microbiology,2011,77(3):983-990.

[3]李孝輝,錢玉英. 大麥飼料的開發及β—葡聚糖酶的應用[J]. 糧食與飼料工業,1997(8):19-20.

[4]徐敏,李晶,鄭志永. 哈茨木霉產水解熱凝膠的內切β-1,3-葡聚糖酶的分離純化[J]. 食品工業科技,2014,35(12):157-161.

[5]暢曉潔,鄭必勝,趙欣. 裂褶菌產內切β-1,3-葡聚糖酶的分離純化[J]. 食品工業科技,2012,33(4):227-229.

[6]陳小云,李堅斌,林瑩.β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶在熱帶水果保鮮中的應用[J]. 食品工業科技,2008(5)：96.

[7]Fujimori N,Enoki S,Suzuki A. Grape apoplasmicβ-1,3-glucanase confers fungal disease resistance in Arabidopsis[J]. Scientia Horticulturae,2016,200:105-110.

[8]Mouyna I,Aimanianda V,Latgé JP. GH16 and GH81 familyβ-(1,3)-glucanases in Aspergillus fumigatus are essential for conidial cell wall morphogenesis[J]. Cellular Microbiology,2016,18(9):1285-1293.

[9]Fuchs K-P,Zverlov VV,Velikodvorskaya GA. Lic16A of Clostridium thermocellum,a non-cellulosomal,highly complex endo-β-1,3-glucanase bound to the outer cell surface[J]. Microbiology,2003,149(4):1021-1031.

[10]Yamamoto M,Ezure T,Watanabe T. C-Terminal domain ofβ-1,3-glucanase H in Bacillus circulans IAM1165 has a role in binding to insolubleβ-1,3-glucan[J]. FEBS Letters,1998,433(1-2):41-43.

[11]Kim PI,Chung K-C. Production of an antifungal protein for control of Colletotrichum lagenarium by Bacillus amyloliquefaciens MET0908[J]. FEMS Microbiology Letters,2004,234(1):177-183.

[12]Hong T-Y,Meng M. Biochemical characterization and antifungal activity of an endo-1,3-β-glucanase of Paenibacillus sp. isolated from garden soil[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2003,61(5-6):472-478.

[13]Hong T-Y,Hsiao Y-Y,Meng M. The 1.5? structure of endo-1,3-β-glucanase from Streptomyces sioyaensis-evolution of the active-site structure for 1,3-β-glucan-binding specificity and hydrolysis[J]. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography,2008,64(9):964-790.

[14]Masuda S,Endo K,Koizumi N. Molecular identification of a novelβ-1,3-glucanase from alkaliphilic Nocardiopsis sp. strain F96[J]. Extremophiles,2006,10(3):251-255.

[15]Jeng WY,Wang NC,Lin CT. Crystal structures of the laminarinase catalytic domain from Thermotoga maritima MSB8 in complex with inhibitors-essential residues for beta-1,3-and beta-1,4-glucan selection[J]. The Journal of Biological Chemistry,2011,286(52):45030-45040.

[16]Fibriansah G,Masuda S,Koizumi N. The 1.3 A crystal structure of a novel endo-beta-1,3-glucanase of glycoside hydrolase family 16 from alkaliphilic Nocardiopsis sp. strain F96[J]. Proteins,2007,69(3):683-690.

[17]Dong W,Huang J,Li Y. Crystal structural basis for Rv0315,an immunostimulatory antigen and inactive beta-1,3-glucanase of Mycobacterium tuberculosis[J]. Scientific Reports,2015,5:15073.

[18]Labourel A,Jam M,Jeudy A. The beta-glucanase ZgLamA from Zobellia galactanivorans evolved a bent active site adapted for efficient degradation of algal laminarin[J]. The Journal of Biological Chemistry,2014,289(4):2027-2042.

[19]Labourel A,Jam M,Legentil L. Structural and biochemical characterization of the laminarinase ZgLamCGH16 from Zobellia galactanivorans suggests preferred recognition of branched laminarin[J]. Acta Crystallographica Section D,Biological Crystallography,2015,71(Pt 2):173-184.

[20]Cota J,Alvarez TM,Citadini AP. Mode of operation and low-resolution structure of a multi-domain and hyperthermophilic endo-beta-1,3-glucanase from Thermotoga petrophila[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,406(4):590-594.

[21]Michel G,Chantalat L,Duee E. The κ-carrageenase of P. carrageenovora features a tunnel-shaped active site-a novel insight in the evolution of Clan-B glycoside hydrolases[J]. Structure,2001,9(6):513-525.

[22]Welfle K,Misselwitz R,Welfle H. Influence of Ca2+on conformation and stability of three bacterial hybrid glucanases[J]. European Journal of Biochemistry,1995,229(3):726-735.

[23]Bleicher L,Prates ET,Gomes TC. Molecular basis of the thermostability and thermophilicity of laminarinases-X-ray structure of the hyperthermostable laminarinase from Rhodothermus marinus and molecular dynamics simulations[J]. The Journal of Physical Chemistry B,2011,115(24):7940-7949.

[24]Ilari A,Fiorillo A,Angelaccio S. Crystal structure of a family 16 endoglucanase from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus-structural basis of substrate recognition[J]. The FEBS Journal,2009,276(4):1048-1058.

[25]Krah M,Misselwitz R,Politz O. The laminarinase from thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus[J]. European Journal of Biochemistry,1998,257(1):101-111.

[26]Davies G,Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases[J]. Structure,1995,3(9):853-859.

[27]Wojtkowiak A,Witek K,Hennig J. Structures of an active-site mutant of a plant 1,3-β-glucanase in complex with oligosaccharide products of hydrolysis[J]. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography,2013,69(1):52-62.

[28]Chen L,Garrett TP,Fincher GB. A tetrad of ionizable amino acids is important for catalysis in barleyβ-glucanases[J]. Journal of Biological Chemistry,1995,270(14):8093-8101.

[29]Witek AI,Witek K,Hennig J. Conserved Cys residue influences catalytic properties of potato endo-(1→3)-β-glucanase GLUB20-2[J]. Acta Biochimica Polonica,2008,55(4):791-797.

[30]Akiyama T,Shibuya N,Hrmova M. Purification and characterization of a(1→3)-β-D-glucan endohydrolase from rice(Oryza sativa)bran[J]. Carbohydrate Research,1997,297(4):365-374.

[31]Peumans WJ,Barre A,Derycke V. Purification,characterization and structural analysis of an abundantβ-1,3-glucanase from banana fruit[J]. European Journal of Biochemistry,2000,267(4):1188-1195.

Progress in the structure and catalytic mechanism ofβ-1,3-glucanases

WANG Rui,YANG Jun*,YANG Qing

(School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

β-1,3-glucanases are widespread throughout bacteria,fungi,plants and invertebrates. They play various physiological roles due to the diversity of origin,such as participating in plant growth and development,defending against pathogens in plant,providing nutrients for bacteria,regulating fungal cell wall stability and rigidity,and involving in the release and invasion of virus. The research of enzyme structure is the basis to explore the mechanism of enzyme catalyzed reaction,to characterize enzyme catalytic properties and to design and transform the enzyme. The structure and catalytic mechanism of GH16 bacterialβ-1,3-glucanase were thoroughly reviewed. By comparing with the structure of GH17 plantβ-1,3-glucanases,this study was attempted to reveal how bacterialβ-1,3-glucanases hydrolyze polysaccharide,and provides an important reference for further modification and utilization of bacterialβ-1,3-glucanases in plant protection,food and pharmaceutical fields.

β-1,3-glucanases;crystal structure;catalytic mechanism;substrate specificity

2017-01-05

王瑞(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:糖苷水解酶的結構功能研究,E-mail：raywangbio@gmail.com。

*通訊作者:楊君(1972-)，女，博士，副教授，研究方向:蛋白質結構與功能研究,E-mail：junyang@dlut.edu.cn。

國家重點研發計劃(2016YFD0200502)；遼寧省自然科學基金(2015020782)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)14-0314-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.062