5′-核苷酸對慢性酒精中毒誘導大鼠結腸功能損傷的影響

鮑 雷,肖 楊,蔡夏夏,王 楠,李 勇(.北京大學國際醫院營養科,北京 006; .北京大學醫學部公共衛生學院營養與食品衛生學系,北京 009)

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5′-核苷酸對慢性酒精中毒誘導大鼠結腸功能損傷的影響

鮑 雷1,肖 楊1,蔡夏夏2,王 楠2,李 勇2
(1.北京大學國際醫院營養科,北京 102206; 2.北京大學醫學部公共衛生學院營養與食品衛生學系,北京 100191)

探討外源性5′-核苷酸對酒精誘導大鼠結腸功能紊亂的保護作用。50只SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、酒精模型組、等熱量對照組及0.04%、0.16%核苷酸組。連續酒精灌胃6周后,結果發現,外源性5′-核苷酸能夠有效改善酒精引起的大鼠結腸病理性改變,顯著提高結腸功能相關蛋白Claudin和Occludin的表達水平(p<0.01或p<0.05),極顯著降低大鼠結腸組織中Toll樣受體4(TLR4)和分化抗原簇14(CD14)的表達水平(p<0.01);外源性5′-核苷酸能夠顯著增加大鼠回腸內容物中雙歧桿菌(酒精組8.00 log CFU/g,核苷酸組8.32 log CFU/g)和乳酸桿菌數量(酒精組7.44 log CFU/g,核苷酸組8.13 log CFU/g)(p<0.05),同時顯著減少腸球菌(酒精組7.52 log CFU/g,核苷酸組7.03 log CFU/g)及大腸桿菌數量(酒精組6.85 log CFU/g,核苷酸組6.19 log CFU/g)(p<0.05)。因此,外源性5′-核苷酸能夠通過調節腸道菌群改善酒精引起的大鼠結腸損傷。

5′-核苷酸,結腸功能,腸道菌群

近年來,酒精攝入引起相關的健康問題逐漸受到人們的重視。2005年世界衛生組織(WHO)明確指出,在全球范圍內酒精導致4%的患病率和3.2%的死亡率,如酒精性肝病、慢性胰腺炎、胃炎、出血性卒中、高血壓、心臟病以及惡性腫瘤等[1]。長期過量飲酒或飲用高度酒均會對健康產生一定的不良影響,嚴重時可導致脂肪肝、肝硬變并損傷中樞神經系統及心臟功能。目前關于酒精所致疾病的研究主要集中于酒精性肝病,但酒精性肝病的發病過程中伴隨著腸道屏障功能的變化[2]。酒精攝入可增加機體小腸黏膜通透性,引發腸道屏障功能障礙,促使腸源性內毒素滲漏形成腸源性內毒素血癥,從而進一步加重肝臟損傷[3]。此外,有實驗證實酒精對人和實驗動物的胃腸道運動均有一定的抑制作用,長期飲用可引起胃腸道粘膜表面發生病理性變化[4-7]。

近年來有研究發現腸道菌群在維持腸道屏障功能方面有重要作用,并且與酒精所致疾病密切相關[8]。核苷酸是由核苷與磷酸通過酯鍵結合構成的生物分子,盡管核糖上的游離羥基(核糖的C-2′,C-3′,C-5′及脫氧核糖的C-3′,C-5′)均能與磷酸發生酯化反應,但生物體內多數核苷酸的酯化反應都是在C-5′原子上,都是屬于5′-核苷酸。5′-核苷酸具有多種生物學作用,如免疫調節作用,延緩衰老作用,抑制腫瘤,保護肝臟,并對胃腸道的生長、修復和分化有重要作用[9]。研究發現,5′-核苷酸能夠改善配方食品組嬰幼兒腸道菌群的組成,促進雙歧桿菌的生長,直接抑制擬桿菌屬-卟啉單胞菌屬-普氏菌屬的生長,因此,核苷酸補充具有直接的益生菌效應[10]。目前有關核苷酸對酒精引起的結腸功能變化的相關研究未見報道。因此,本研究通過動物實驗觀察酒精對實驗大鼠結腸功能的影響,并探討外源性5′-核苷酸的保護作用,為5′-核苷酸應用于酒精性結腸損傷的預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5′-核苷酸混合物(純度99%,5′AMP∶5′CMP∶5′GMPNa2∶5′UMPNa2=22.8-26.6-20.4-30.2) 大連珍奧生物工程股份有限公司;基礎飼料 美國營養學會(American Institute of Nutrition,AIN-93G)純化飼料;添加核苷酸飼料配方 在AIN-93G純化飼料基礎上分別以0.4 g/kg和1.6 g/kg的比例添加核苷酸,北京華阜康生物科技股份有限公司;右旋糖(純度≥99.5%) 美國Sigma公司;抗閉合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、TLR4、CD14、β-actin抗體 美國Santa Cruz公司;聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜 美國Millipore公司;BD Difco脫脂奶粉skim milk 上海力敏實業有限公司;IgG辣根過氧化物酶標記二抗 北京中杉金橋生物技術有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒 北京碧云天生物技術有限公司;ECL顯色試劑盒 北京普利萊基因技術有限公司;微生物培養基 青島海博生物技術有限公司。

Eppendorf Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;AdventurerTM通用型分析天平 美國OHAUS公司;Biorad550型酶聯免疫檢測儀 美國BioTek公司;尼康E100生物顯微鏡 日本尼康公司;IKAMS2型振蕩器 德國 IKA公司;TYZD-II型水平搖床 上海精密科學儀器有限公司;Bio-rad垂直平板電泳槽 美國 Bio-Rad公司;DYCZ-30B垂直電泳儀 北京六一儀器廠;WDD-1發光測試儀 北京第二光學儀器廠;BCD-260WDGQ型低溫冰箱 海爾集團;MDF-C8V1超低溫冰箱 日本三洋公司;HH-2電熱恒溫水浴箱 上海躍進醫療器械廠。

1.2 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠,9周齡,300～350 g,由北京大學醫學部實驗動物中心提供(實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2011-0012)。實驗動物分籠飼養,每籠3只,自由飲食、飲水。動物飼養在北京大學醫學部實驗動物科學部,動物實驗環境為SPF級,溫度范圍(22±1) ℃,相對濕度40%～50%,室內照明控制在12 h/12 h光暗周期節律。

1.3 實驗動物分組及處理

雄性SPF級Wistar大鼠50只,適應性喂養2周,按體重隨機分為正常對照組(Normal control group)、酒精模型組(Alcohol control group)、等熱量對照組(Dextrose control group)、0.04%和0.16%核苷酸(NTs)干預組,每組10只,除正常對照組和等熱量對照組外,其余30只大鼠使用50%酒精(v/v)灌胃,為提高大鼠對酒精的適應性,酒精初始灌胃量為每天2 g/kg·bw,隨后每天增加0.5 g/kg·bw,2周后灌胃劑量達到并穩定在8 g/kg·bw,此為維持劑量,之后每天灌胃2次(灌胃時間為8:00 a.m.和3:00 p.m.),每次灌胃酒精4 g/kg·bw,繼續干預4周,干預第6周末用代謝籠準確量取各組大鼠進食量。正常對照組每天灌胃等體積的蒸餾水,等熱量對照組每天灌胃與酒精模型組熱量相等的右旋糖溶液(0.875 g/mL)。正常對照組、酒精模型組和等熱量對照組大鼠給予AIN-93G飼料喂養,0.04%和0.16%核苷酸干預組是在AIN-93G飼料基礎上每千克分別添加0.4 g和1.6 g核苷酸所制成。

1.4 結腸組織切片形態學觀察

大鼠處死后,迅速分離橫結腸中段1～2 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規制作石蠟切片,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,使用光學顯微鏡進行形態學觀察。

1.5 Western Blotting檢測蛋白表達

取0.1 g結腸組織,加入冰預冷的RIPA裂解液,置于冰上并用玻璃勻漿器充分勻漿至完全裂解,4 ℃,12000 r/min,離心5 min后吸取上清液。采用2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)法進行蛋白定量。樣品經SDS-PAGE電泳,濕轉法轉膜2 h后轉至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后,分別將抗閉合蛋白(Claudin)(1∶200)、咬合蛋白(Occludin)(1∶200)、Toll樣受體4(TLR4)(1∶200)、分化抗原簇14(CD14)(1∶200)和β-actin(1∶1000)抗體用5%牛血清白蛋白稀釋,4℃孵育過夜。洗膜后以辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶4000)于37 ℃恒溫箱中孵育1 h。采用增強化學發光法進行成像,WDD-1發光測試儀檢測。β-actin作為內參,利用Image Pro-plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Inc.)進行灰度分析[11]。

1.6 腸道菌群培養

按照培養基說明配制所需培養基,處死大鼠后,迅速取大鼠結腸內容物0.1 g,加入10 mL無菌生理鹽水中,充分振蕩混勻,再稀釋到所需濃度。雙歧桿菌采用10-4、10-5和10-6三個稀釋度,滴種2 μL標本液于培養基上;乳酸桿菌采用10-3、10-4和10-5三個稀釋度,點樣體積2 μL;大腸桿菌、腸球菌均采用10-4和10-5兩個濃度,點樣體積5 μL。

表1 各組大鼠24 h進食量Table 1 The food intake of rats for 24 h

圖1 各組大鼠結腸組織病理學結構變化(400×)Fig.1 The pathological structure change in colon of rats(400×)注:A:正常對照組;B:酒精模型組;C:等熱量對照組;D:0.04%核苷酸組;E:0.16%核苷酸組;圖2、圖4同。

雙歧桿菌、乳酸桿菌置于37 ℃恒溫厭氧罐內倒置培養48 h,大腸桿菌及腸球菌置于37 ℃生化培養箱內倒置培養24 h。培養結束后,觀察并記錄每克結腸內容物的菌落數量,結果表示為lg CFU/g。

1.7 統計方法

所有實驗數據均以x±s表示。采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析,p<0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組大鼠24 h進食量

如表1所示,各組大鼠24 h進食量沒有顯著性差異(p>0.05)。

2.2 各組大鼠結腸組織病理學結構變化

如圖1(A和C)所示,正常對照組和等熱量對照組大鼠腸道結構完整,粘膜層、固有層、粘膜下層和肌層清晰可見,粘膜層和固有層杯狀細胞豐富、腸腺發達、排列規則;酒精模型組大鼠結腸粘膜不完整,杯狀細胞減少,可見潘氏細胞,粘膜下層可見炎性細胞浸潤,肌層不完整(圖1B);與酒精模型組相比,核苷酸干預組大鼠結腸粘膜較為完整,炎性細胞減少,肌層較完整(見圖1D和E),表明核苷酸可有效改善酒精引起的大鼠結腸組織病理性結構變化。

2.3 各組大鼠結腸功能相關蛋白Claudin和Occludin的表達變化

Claudin和Occludin是細胞間轉運過程中構成緊密連接的主要跨膜蛋白,在腸道屏障功能發揮中扮演著重要角色。如圖2及圖3所示,與等熱量對照組相比,酒精模型組大鼠結腸組織中Claudin和Occludin的表達均顯著降低(p<0.01),說明酒精能夠破壞結腸上皮細胞間緊密連接,影響其結構和功能,在一定程度上增加了結腸通透性;與酒精模型組相比,5′-核苷酸干預能夠顯著上調結腸組織中Occludin和Claudin的蛋白表達水平(p<0.01或p<0.05),且呈劑量依賴關系,表明核苷酸干預可以有效提高大鼠結腸組織中Claudin和Occludin的表達水平,從而改善酒精引起的結腸結構和功能損傷。

圖2 各組大鼠結腸功能相關蛋白電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of colon function related protein in rats

圖3 各組大鼠結腸功能相關蛋白表達的變化Fig.3 The expression of colon function related protein in rats.注:與等熱量對照組相比,*p<0.05,**p<0.01; 與酒精模型組相比,#p<0.05,##p<0.01;圖5、表1同。

表2 各組大鼠回腸內容物雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及大腸桿菌變化Table 2 Changes of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,E. coli in ileum contents of rats(±s,n=10)

2.4 各組大鼠結腸組織中TLR4和CD14的表達變化

如圖4及圖5所示,與等熱量對照組相比,酒精模型組大鼠結腸組織中TLR4和CD14蛋白表達水平顯著增高(p<0.01);而與酒精模型組相比,膳食中添加0.04%和0.16%核苷酸組能夠極顯著抑制酒精引起的大鼠結腸組織中TLR4和CD14蛋白表達水平的升高(p<0.01)。

圖4 各組大鼠結腸組織中TLR4和CD14蛋白電泳圖Fig.4 The electrophoretogram of TLR4 and CD14 in colon of rats

圖5 各組大鼠結腸組織中TLR4和CD14的表達變化Fig.5 The protein expression levels of TLR4 and CD14 in colon of rats

TLR4和CD14為LPS/LPS結合蛋白(LPS-binding protein,LBP)復合物受體,可介導LPS引起的炎癥反應[12]。Hritz等[13]研究發現,酒精攝入會導致野生型小鼠TLR4、CD14及炎癥因子水平明顯升高。人群研究也發現酗酒者體內內毒素和CD14水平明顯高于健康者[14]。本實驗中發現了類似的結果,酒精模型組大鼠結腸組織中TLR4和CD14的表達水平顯著增高(p<0.01),推測其原因可能是酒精引起的腸道菌群紊亂導致有害菌大量增長,通過結腸上皮進入血液,出現內毒素血癥。而外源性5′-核苷酸能夠極顯著降低大鼠結腸組織中TLR4和CD14的表達水平(p<0.01),說明核苷酸能夠促進腸道菌群結構的改善,進而緩解內毒素血癥所致的結腸結構和功能障礙,這可能是核苷酸發揮結腸保護作用的機制之一。

2.5 各組大鼠回腸內容物中腸道菌群變化

如表2所示,與等熱量對照組相比,酒精模型組大鼠回腸內容物中雙歧桿菌減和乳酸桿菌均顯著減少(p<0.05),而腸球菌及大腸桿菌數量顯著增多(p<0.05)。與酒精模型組相比,0.04%和0.16%核苷酸組大鼠回腸內容物中雙歧桿菌和乳酸桿菌數量顯著增多(p<0.05);同時0.04%和0.16%核苷酸組大鼠回腸內容物中腸球菌及大腸桿菌數量較酒精模型組顯著減少(p<0.05)。

研究證實,腸道菌群與宿主的各種生理功能息息相關,直接參與機體的消化、吸收、能量代謝和免疫調節等生理活動[15-17]。腸道菌群紊亂也會引胃腸道疾病(結腸癌、非炎癥性腸病)及慢性非傳染性疾病(肥胖、糖尿病等)等疾病的發生[18-19]。在腸道菌群中,擬桿菌門和厚壁菌門占主要地位,二者大約占微生物總量的90%,正常情況下,這些腸道微生物處于動態平衡狀態[20]。然而,過量攝入酒精可導致腸道菌群結構發生失衡,乳桿菌、雙歧桿菌、多形桿狀菌等主要產短鏈脂肪酸菌屬數量大幅下降,使得短鏈脂肪酸產生減少,造成腸粘膜營養不足,還可減少與腸上皮細胞增殖和分化密切相關的GLP-2表達,進而會抑制腸上皮緊密連接蛋白-1(ZO-1)和Occludin蛋白的表達,使腸道的屏障功能受損,腸道的通透性增加,促進大量脂多糖(LPS)由腸道入血;另一方面,酒精可促進腸球菌和大腸桿菌等的繁殖,LPS大量增加,導致內毒素血癥,引起嚴重炎癥反應[21]。本實驗結果表明,酒精模型組大鼠回腸內容物中有益菌群雙歧桿菌和乳酸桿菌較等熱量對照組顯著降低(p<0.05),而腸球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌顯著增多(p<0.05),表明酒精可引起大鼠回腸內腸道菌群紊亂;核苷酸干預能夠改善酒精引發的大鼠腸道菌群紊亂,這與早期報道相一致[22]。

3 結論

采用50%乙醇灌胃,成功誘導大鼠結腸功能損傷,實驗結果初步證明膳食添加核苷酸能夠有效減輕酒精引起的結腸結構損傷,顯著提高結腸功能相關蛋白Claudin和Occludin的表達,其作用機制可能與核苷酸能夠有效調節腸道菌群,顯著降低LPS介導受體TLR4和CD14的表達水平有關。本研究為5′-核苷酸應用于酒精性結腸損傷的臨床營養治療提供了實踐證明和理論依據。但其保護作用的具體調節通路及最佳攝入量仍有待進一步探究。

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Effects of 5′-nucleotides on the injury of colon function induced by chronic alcoholism in rats

BAO Lei1,XIAO Yang1,CAI Xia-xia2,WANG Nan2,LI Yong2

(1.Department of Nutrition and Dietetics,Peking University International Hospital,Beijing 102206,China; 2.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Peking University,Beijing 100191,China)

The aim of this study was to investigate the protective effects of exogenous 5′-nucleotides on alcohol induced colon function injury in SD rats. Fifty SPF male Wistar rats were randomly divided into normal control group,alcohol model group,dextrose control group,0.04% and 0.16% nucleotides intervention group. After continuous ethanol lavage for 6 weeks,the results showed that exogenous 5′-nucleotides could effectively improve the pathological changes of colon in rats induced by alcohol,increase the expression levels of Claudin and Occludin and reduce the levels of TLR4 and CD14 in colon tissues(p<0.01). The numbers ofBifidobacterium(8.32 vs. 8.00 log CFU/g)andLactobacillus(8.13 vs. 7.44 log CFU/g)in ileum contents were significantly decreased,and the numbers ofEnterococcus(7.03 vs. 7.52 log CFU/g)andE.coli(6.19 vs. 6.85 log CFU/g)were significantly decreased in nucleotides intervention groups when compared with the alcohol model group(p<0.05). Therefore,exogenous 5′-nucleotides could improve the alcohol induced colon function injury in rats which may attribute to the regulation of gut microbiota.

5′-nucleotides;colon function;gut microbiota

2016-11-28

鮑雷(1984-),男,博士,主管技師,研究方向:營養與疾病,E-mail:baolei6230@163.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.059