桑葚粗提液對壬基酚誘導大鼠焦慮行為的干預作用及其機制

劉 煥,楊 婕,黃少文,劉瑞菁,賀永健,柳春紅(華南農業大學食品學院,廣東省食品質量安全重點實驗室,廣東廣州 510642)

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桑葚粗提液對壬基酚誘導大鼠焦慮行為的干預作用及其機制

劉 煥,楊 婕,黃少文,劉瑞菁,賀永健,柳春紅*
(華南農業大學食品學院,廣東省食品質量安全重點實驗室,廣東廣州 510642)

目的:探討桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠焦慮行為的干預效果。方法:48只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組(玉米油)、桑葚對照組(桑葚粗提液,按多酚含量計,120 mg/kg)、壬基酚染毒組(270 mg/kg)、桑葚粗提液低、中、高劑量干預組(壬基酚灌胃劑量均為270 mg/kg,桑葚粗提液干預劑量分別為30、60和120 mg/kg),利用曠場實驗(OFT)和高架十字迷宮(EPM)來觀察桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠焦慮行為的影響,并用ELISA試劑盒檢測單胺類神經遞質5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素水平和單胺氧化酶活性。結果表明,高劑量干預組大鼠在曠場實驗中進入中央區域距離、進入中央區域的次數以及在高架十字迷宮實驗中進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比均顯著高于染毒組(p<0.05)。與壬基酚染毒組相比,高劑量干預組大鼠下丘腦5-羥色胺和多巴胺水平,中劑量干預組大鼠下丘腦多巴胺水平顯著下調(p<0.05),而且高劑量干預組還明顯上調單胺氧化酶的活性(p<0.05)。同時隨著干預劑量的增加,去甲腎上腺素水平逐漸降低但并無顯著性差異。結論:桑葚粗提液降低壬基酚所致焦慮大鼠下丘腦5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素水平,其作用機制可能與上調下丘腦單胺氧化酶的活性有關。

壬基酚,桑葚提取液,單胺類神經遞質,曠場實驗,高架十字迷宮

壬基酚聚氧乙烯醚硫酸鈉(Nonylphenol Ethoxylates,NPEs)被廣泛用于生產非離子表明活性劑、洗滌劑、橡膠、絕緣材料等,在日用品、醫藥、農藥、化妝品、玩具等數十個行業中均有存在[1]。壬基酚(Nonylphenol)是合成NPEs的單體,是酚類環境雌激素之一,廣泛存在于環境中[2]。目前關于壬基酚對環境污染的研究主要集中于水體污染方面[3-6];關于壬基酚毒性的研究則基本集中于生殖毒性和免疫毒性方面[7-9],同時有研究表明環境雌激素(壬基酚,鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯)通過影響神經遞質間接導致焦慮[10-11]。目前針對外源化學物的毒性干預研究報道不多,對壬基酚神經行為毒性的干預更是鮮有報道。

桑葚,又稱桑果、桑棗,被衛生部列為“既是食品又是藥品”的產品之一,具有較高的營養價值[12-13]。到目前為止,從桑葚中已分離出150多種化合物,其中活性物質主要為多酚和活性多糖[14]。研究認為,桑葚具有防癌、抗氧化、抗衰老、降血糖、提高免疫力、改善大腦功能等功效[15-17]。同時有研究表明桑葚可影響大鼠的焦慮行為[18-19]。鑒于焦慮在現代生活中普遍發生,本研究以食品或環境污染物壬基酚為染毒物質,以桑葚提取液進行干預,通過曠場實驗和高架十字迷宮兩類神經行為學評價方法,從單胺神經遞質的角度來分析桑葚提取液對壬基酚染毒大鼠的神經調節作用,以期為人類焦慮預防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮成熟桑葚 國家桑樹種植資源華南分圃;壬基酚 純度>99.9%,美國Sigma公司;大鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒、大鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒、大鼠多巴胺(DA)ELISA試劑盒、大鼠單胺氧化酶(MAO)ELISA試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠 48只,4～5周,體重70～90 g,動物及飼料均購自廣東省醫學實驗動物中心,實驗動物合格證號:SCXK(粵)2013-0002,華南農業大學實驗動物中心許可證號:SYXK(粵)2014-0136。

曠場實驗箱(OFT)、高架十字迷宮(EPM) 上海移數信息科技有限公司;Multiskan Mk3型多功能酶標儀 美國Thermo Fisher公司;Ethovision 8.0型行為軌跡跟蹤分析系統 荷蘭Noldus公司;大鼠飼養籠 蘇杭科技器材有限公司;Lab-1B-80真空冷凍干燥機 北京博醫康有限公司;ultraLC 110-XL HPLC AB SCIEX Triple TOF 5600超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀 美國SCIEX公司。

1.2 桑葚粗提液制備

參考胡金奎的方法[20],略有改動。新鮮桑葚冷凍干燥后粉碎過60目篩,樣品-20 ℃儲存備用;準確稱取一定量的桑葚粉末,浸入一定量乙醇(體積分數80%、料液比為1∶15),超聲輔助提取90 min,桑葚果渣重復超聲提取,得到的總提取液在3000 r/min的條件下離心10 min,隨之進行真空抽濾,濾液于45 ℃減壓旋蒸除去乙醇并濃縮,儲存于4 ℃備用。

1.3 多酚含量測定

采用福林-酚法測定桑葚粗提液多酚含量[21]。

標準曲線的建立:準確稱取沒食子酸標準品50 mg,用乙醇(80%)定容至50 mL,得到沒食子酸標準母液(1 mg/mL)。分別將母液稀釋成50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的標準液。分別取125 μL的標準液加入125 μL的福林酚混合靜置6 min,加入7% Na2CO3(1.25 mL),用水調至3 mL(加水1.5 mL),放置90 min,760 nm測定吸光度,得到標準曲線。

樣品測定:將提取液稀釋100倍,取125 μL按上述步驟測定吸光度,以標準曲線回歸方程計算桑葚粗提液多酚的含量。

1.4 實驗動物分組與處理

大鼠單籠飼養,光/暗周期12 h/12 h(光照時間07:00～19:00),室內溫度為(22±0.5) ℃,濕度為50%～60%。大鼠適應性飼養7 d,適應期及干預期內所有大鼠自由攝食和飲水。適應期后按體重采用隨機區組設計分組法分為6組:正常對照組、壬基酚染毒組、桑葚對照組、桑葚粗提液低、中、高劑量干預組,每組8只。正常對照組:玉米油;壬基酚染毒組:壬基酚270 mg/kg;桑葚對照組:以多酚含量計,120 mg/kg;3個干預組為壬基酚270 mg/kg+桑葚粗提液30、60或120 mg/kg。每天上午9:00干預組與染毒組灌胃壬基酚(溶于玉米油),正常對照組和桑葚對照組灌胃等體積(2 mL)玉米油;1 h后,桑葚對照組和干預組灌胃桑葚粗提液(溶于生理鹽水),對照組與染毒組灌胃等體積(2 mL)生理鹽水,連續灌胃28 d。

1.5 行為學測試

行為實驗前,徹底清潔OFT和EPM裝置,設置好相關程序,保證實驗室通風良好。干預前后均提前1 h將所有大鼠轉移至行為學實驗室,以適應環境。實驗開始時,從籠內輕輕取出大鼠(背對實驗者),將大鼠放入OFT和EPM裝置,實驗者立即離開,通過動物行為軌跡跟蹤系統采集大鼠5 min內在OFT和EPM中的活動信息。實驗結束后用75%的酒精徹底清潔裝置,并用紙巾擦干。行為學評價指標包括:曠場實驗:總距離、中央區運動距離、進入中央區時間、進入中央區次數、直立次數和修飾次數;高架十字迷宮:進入開臂時間百分比、進入開臂次數百分比和入臂總次數。

1.6 下丘腦單胺類神經遞質與MAO的測定

行為學實驗結束后,各組大鼠斷頸處死,解剖出下丘腦,并稱重,用預冷的PBS溶液沖洗下丘腦表面的血跡,濾紙吸干,制成10%下丘腦勻漿,在2000 r/min、4 ℃下離心20 min,取上清液,用相應的ELISA試劑盒分別測定其5-HT、NE、DA及MAO的水平。

1.7 統計學處理方法

表1 干預前各組大鼠OFT行為比較Table 1 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

表2 干預后各組大鼠OFT行為比較Table 2 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

注:與正常對照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與壬基酚染毒組相比,#p<0.05,##p<0.01;表3、表4、圖2～圖5同。

所有數據以Mean±SD表示,n=8。采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),進一步進行組間兩兩比較,若方差齊時,采用LSD檢驗;若方差不齊,則采用Tamhane’s檢驗,p<0.05認為差異顯著,p<0.01差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葚粗提液多酚含量

沒食子酸標準曲線y=0.0034x-0.0298,R2=0.9984,得到桑葚粗提液多酚的含量為(34.86±0.09) mg/mL。

2.2 行為學實驗結果

2.2.1 OFT結果 由OFT是利用動物對新異環境的恐懼和探究的矛盾心理特性來考察動物的焦慮狀態[22]。動物的焦慮程度越高,越傾向于在周邊區域活動[23]。大鼠在中央區域運動的距離越長,進入中央區域的時間越長,進入中央區域的次數越多,就說明大鼠的焦慮程度越低。表1可知,各組大鼠曠場行為學結果在干預前均無顯著性差異(p>0.05)。

由表2可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠各指標變化不大,無顯著性差異,為后文干預組與對照組和染毒組比較提供前提條件。與正常對照組相比,染毒組大鼠中央區域運動的距離、進入中央區域的時間和進入中央區域的次數均極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,壬基酚能使大鼠產生一定的焦慮。與染毒組相比,高劑量桑葚提取液干預組大鼠中央區域運動距離和進入中央區域的次數顯著增加(p<0.05),說明桑葚粗提液具有一定的改善大鼠焦慮的效果,起到了一定的干預效果。同時隨著干預劑量的增加,大鼠進入中央區域的距離、進入中央區域的時間和進入中央區域的次數均逐漸增加。

2.2.2 EPM結果 EPM是利用動物對新異環境的探究和對高懸開臂的恐懼形成的矛盾心理來考察動物的焦慮狀態[24]。大鼠進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比越高,說明大鼠焦慮程度越低,反之亦然。由表3可知,各組大鼠EMP學結果在干預前均無顯著性差異(p>0.05)。

表3 干預前各組大鼠EPM行為比較Table 3 Comparison of elevated plus-maze behavior of rats before the experimental intervention

由表4可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠各指標變化不大,無顯著性差異,為后文干預組與對照組和染毒組比較提供前提條件。與對照組相比,染毒組大鼠進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,壬基酚能使大鼠產生一定的焦慮。與染毒組相比,高劑量桑葚粗提液干預組大鼠進入開臂時間百分比顯著降低(p<0.05),進入開臂次數百分比極顯著增加(p<0.01),中劑量桑葚粗提液干預組大鼠進入開臂次數百分比顯著增加(p<0.05),說明桑葚粗提液具有一定的改善焦慮的效果,起到了一定的干預效果。同時隨著干預劑量的增加,大鼠進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比均逐漸增加。

表4 干預后各組大鼠EPM行為比較Table 4 Comparison of open-field test behavior of rats after the experimental intervention

注:與正常對照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與壬基酚染毒組相比,#p<0.05,##p<0.01。

綜上所述,干預后,壬基酚染毒組大鼠進入中央區域距離、進入中央區域的時間及進入中央區域次數極顯著低于正常對照組(p<0.01),壬基酚染毒組大鼠進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比也極顯著低于正常對照組(p<0.01),兩種行為學測試都一致表明:壬基酚暴露誘導大鼠產生焦慮行為。由于壬基酚、雙酚A等環境內分泌干擾物與17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的化學結構相似,能與雌激素受體結合,在機體內模擬E2發揮作用[25]。由此可推斷,壬基酚可能與雙酚A一樣發揮擬雌激素樣相應,影響E2與雌激素受體的結合,從而使大鼠產生焦慮的狀況。同時Yadav等[18]發現桑葚乙醇提取物可以顯著增加大鼠在高架十字迷宮實驗中進入開臂的次數和時間,而且還顯著增加大鼠在曠場實驗中穿越格子數,起到了一定的抗焦慮作用,與本研究結果一致。

2.3 桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠下丘腦神經遞質及酶的影響

2.3.1 桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠下丘腦5-HT的影響 由圖1可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠下丘腦5-HT含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦5-HT含量極顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取物處理組大鼠下丘腦5-HT含量呈下降趨勢,其中高劑量處理組大鼠下丘腦5-HT含量顯著降低(p<0.05),說明桑葚粗提液能夠一定程度地緩解這種損傷,起到了一定的干預作用。

圖1 各組大鼠下丘腦5-HT水平的變化Fig.1 Changes in the hypothalamic of rats 5-HT levels

2.3.2 桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠下丘腦NE含量的影響 由圖2可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠下丘腦NE含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦NE含量極顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取液處理組大鼠下丘腦NE含量呈下降趨勢,但差異不顯著,說明桑葚粗提液對大鼠下丘腦NE的作用并不是很明顯。

圖2 各組大鼠下丘腦NE水平的變化Fig.2 Changes in the hypothalamic of rats NE levels

2.3.3 桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠下丘腦DA含量的影響 由圖3可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠下丘腦DA含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦DA含量顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取液處理組大鼠下丘腦DA含量呈下降趨勢,其中中劑量和高劑量處理組大鼠下丘腦DA含量顯著降低(p<0.05),說明桑葚粗提液能夠一定程度的改善這種損傷作用,起到了一定的干預作用。

圖3 各組大鼠下丘腦多巴胺水平的變化Fig.3 Changes in the hypothalamic of rats dopamine levels

2.3.4 桑葚粗提液對壬基酚染毒大鼠下丘腦MAO活力的影響 如圖4可知,與正常對照組相比,桑葚對照組大鼠下丘腦MAO活力無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦MAO活力極顯著降低(p<0.01),說明壬基酚對下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,僅桑葚提取液高劑量處理組大鼠下丘腦MAO活力極顯著升高(p<0.01),說明桑葚粗提液能夠一定程度的改善這種損傷作用,起到了一定的干預作用。

圖4 各組大鼠下丘腦MAO水平的變化Fig.4 Changes in the hypothalamic of rats MAO levels

桑葚具有良好的保健作用,本實驗中桑葚粗提液的主要活性物質是多酚類物質。本實驗結果表明，桑葚粗提液可以通過增加MAO活性來降低神經遞質的含量,起到一定的抗焦作用。Xu等研究[26]發現反白藜蘆醇能上調大鼠腦內的5-HT、NE和DA的水平,降低MAO的活性,起到了白藜蘆醇相反的效果從側面說明白藜蘆醇的抗焦慮作用;劉露[27]研究發現蘆丁可以上調染毒三甲基氯化錫大鼠腦內的5-HT、NE和DA的水平,這可能是因為三甲基氯化錫毒性作用使5-HT、NE和DA的水平過低,蘆丁一定的解毒作用,使神經遞質水平維持平衡;劉倩佟等[28]發現槲皮素能下調大鼠腦內5-HT和DA的水平;同時本研究質譜分析顯示桑葚粗提液有花色苷(矢車菊-3-葡萄糖苷)、蘆丁、槲皮素、白藜蘆醇等[29],由此推測可能是這類物質起到的干預作用。

3 結論

現代醫學認為5-HT、NE、DA等神經遞質水平的增加,是引起焦慮病的原因之一[30-32]。研究表明,雌激素能抑制大鼠腦中MAO酶活性[33],而本實驗結果顯示,壬基酚染毒后的大鼠下丘腦內5-HT、NE、DA的含量極顯著升高(p<0.01),焦慮大鼠亦出現MAO活性極顯著降低(p<0.01)。由此推測壬基酚是通過降低MAO酶的活性從而阻斷單胺類神經遞質的正常分解,使得腦內單胺類神經遞質的水平升高而導致焦慮。同時桑葚粗提液干預組大鼠下丘腦中5-HT、NE、DA水平明顯降低,MAO水平明顯升高,提示桑葚粗提液特別是高劑量桑葚粗提液可以有效干預壬基酚染毒所引起的焦慮。本研究為桑葚的深加工提供了一定的借鑒,同時也為壬基酚毒性干預研究提供了思路。

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Intervention effects and mechanism research of mulberry crude extract on nonylphenol anxiety behavior of SD rats induced by nonylphenol

LIU Huan,YANG Jie,HUANG Shao-wen,LIU Rui-jing,HE Yong-jian,LIU Chun-hong*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Key Laboratory of Food Quality and Safety in Guangdong Province,Guangzhou 510642,China)

The aim of this study was toinvestigate the interventioneffects of mulberry crude extract(MCE)on anxiety behaviors of SD rats exposed to nonylphenol(NP). 48 SPF rats were randomly divided into 6 goups:normal control group(corn oil),MCE control group(120 mg/kg),NP model group(270 mg/kg),and three intervention groups(120 mg/kg NP+30 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+60 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+120 mg/kg MCE). The open field test(OFT)and elevated plus maze(EPM)were used to evaluate anxiety behaviors of the rats while the ELISA kitswere used to detect the levels of monoamine neurotransmitter,including serotonin,dopamine,norepinephrine and monoamine oxidase. The distance traveled in the center and entrance frequency to the center of the high-dose intervention groupwere significantly higher thanthe NP group in the OFT. The percentage of open arm entries and time of the high-dose intervention group rats were significantly higher thanthe NP group in the EPM test(p<0.05). Compared with the nonylphenol group,the hypothalamic serotoninand dopamin levels in the high-dose intervention group were significantly lower(p<0.05),the hypothalamus dopamin level was significantly lower in the middle-dose intervention group(p<0.05)and MAO activity of high dose intervention group was significantly increased(p<0.05). Meanwhile as intervention dose increased,norepinephrine levels gradually reduce with no significant difference. Mulberry crude extract can reduce the levels of serotonin,dopamine,norepinephrine in hypothalamus of rats with anxiety caused by nonylphenol and the underlying mechanism may involve up-regulation of MAO activity.

nonylphenol;mulberry crude extract;monoamine neurotransmitter;open field text;elevated plus maze

2016-12-20

劉煥(1991-)，男，碩士，研究方向：營養與食品安全，E-mail：liuhuanjzcd@126.com。

*通訊作者:柳春紅(1968-)，女，博士，教授，研究方向：營養與食品安全，E-mail：liuch@scau.edu.cn。

廣東省自然科學基金項目(2016A030313395)；農業部農產品質量安全監管項目(GJFP201601106)；廣東省科技計劃項目(2013B020204001)；廣東省現代農業產業技術體系創新團隊建設項目(2016LM2152)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0294-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.058