硒蛋白Se-76P對STZ誘導的小鼠糖尿病腎病模型腎功能及生化指標的影響

李 強,田福俊,魏子敬,葛 鑫,胡 超,王 程(.吉林醫藥學院檢驗學院免疫技術教研室,吉林吉林 303; .吉林醫藥學院臨床醫學院醫學影像系,吉林吉林 303; 3.吉林醫藥學院基礎醫學院生物化學教研室,吉林吉林 303)

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硒蛋白Se-76P對STZ誘導的小鼠糖尿病腎病模型腎功能及生化指標的影響

李 強1,田福俊2,魏子敬2,葛 鑫2,胡 超2,王 程3,*
(1.吉林醫藥學院檢驗學院免疫技術教研室,吉林吉林 132013; 2.吉林醫藥學院臨床醫學院醫學影像系,吉林吉林 132013; 3.吉林醫藥學院基礎醫學院生物化學教研室,吉林吉林 132013)

研究含硒蛋白(Se-76P)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的小鼠糖尿病腎病的保護作用。C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射STZ(40 mg/kg)制備糖尿病腎病模型,將60只小鼠分為六組,正常對照組(Ⅰ組)、糖尿病腎病模型組(Ⅱ組)、模型+Se-76P低劑量組(Ⅲ組)、模型+Se-76P中劑量組(Ⅳ組)、模型+Se-76P高劑量組(Ⅴ組)和模型+胰島素治療組(Ⅵ組)。各組小鼠均采用皮下注射方式給藥,Ⅰ組和Ⅱ組給予生理鹽水;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別給予低(20 μmol/kg)、中(40 μmol/kg)、高(60 μmol/kg)濃度Se-76P蛋白;Ⅵ組給予5 U/kg·d胰島素。各組連續給藥4周,每周測量小鼠體重;實驗結束后檢測各組小鼠空腹血糖、血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平;檢測各組小鼠尿肌酐(UCr)和尿微量白蛋白(MAU)水平,并計算肌酐清除率(CCr);檢測腎組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)水平。與模型組相比,Se-76P各治療組空腹血糖值均降低;SCr、BUN、UCr、MAU水平以及CCr均顯著降低(p<0.01或0.05);腎組織中MDA水平明顯降低(p<0.01),而SOD和GPx活性明顯升高(p<0.01或0.05)。Se-76P可能通過提高SOD和GPx活性,提升抗氧化水平,改善STZ誘導的糖尿病腎病小鼠模型的腎功能。

硒蛋白,Se-76P,鏈脲佐菌素,糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病主要并發癥之一,可引起終末期腎病(end stage kidney disease,ESKD),嚴重威脅患者生命。目前的治療主要依賴早期診斷、血糖控制以及通過抑制腎素-血管緊張素系統嚴格控制血壓等,但由于DKD的發病機制較為復雜,涉及血流動力學改變、體內代謝、氧化應激、炎癥反應等很多環節,一旦發展成為ESKD則很難治療。雖然近年來對DKD的病理生理學機制的研究有了很大進展,但是仍然沒有較為有效的治療方法。研究表明,氧化應激導致的脂質和蛋白質的過氧化,在糖尿病開始后的早期就表現出來[1],因此早期控制糖尿病患者的氧化應激損傷可能是DKD預防和治療的關鍵。

人體內存在著酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統,可以對抗氧化應激損傷,酶抗氧化系統包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)等,非酶抗氧化系統包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽以及微量元素銅、鋅、硒等。硒是人體必需的微量元素之一,大量研究表明,體內硒元素水平與糖尿病的發生和程度密切相關[2-3]。硒元素在體內主要以硒代半胱氨酸(SeCys)形式存在于各種硒蛋白中,如GPx就是一種含硒蛋白。早期研究發現多種硒蛋白具有類胰島素功能[4],其降低血糖的作用可能與抑制促炎細胞因子及活性氧和活性氮的增加有關[5]。

含硒76肽(Se-76P)是一種SOD和GPx雙酶活性中心的含硒多肽,同時具有很強的SOD和GPx活性,可以發揮很好的抗氧化作用[6]。前期研究表明,Se-76P能通過減少線粒體的氧化損傷,保護肝細胞[7]。目前尚沒有Se-76P對腎臟保護作用的研究報道,本文將通過鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的DKD小鼠模型,研究Se-76P對DKD的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6J小鼠 雄性,SPF級,8～12周齡,由長春市億斯實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號:SCXK(吉)2011-0004;硒蛋白(Se-76P) 由本課題組表達并純化;STZ(貨號:S0130) 美國Sigma公司;檸檬酸、檸檬酸鈉 上海實驗試劑有限公司;諾和靈N注射液 丹麥諾和諾德公司;肌酐(creatinine,Cr)檢測試劑盒、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、GPx檢測試劑盒、尿微量白蛋白(microalbuminuria,MAU)定量檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

Model 550型酶標儀 美國Bio-rad公司產品;TD4型臺式低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司產品;SSW-420-2S型電熱恒溫水槽 上海博迅實業有限公司產品;BS124S型分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司產品;AU480型全自動生化分析儀 貝克曼庫爾特商貿有限公司產品;GA-3三諾血糖儀 三諾生物傳感股份有限公司產品。

1.2 實驗分組及給藥

1.2.1 實驗分組 60只C57BL/6J雄性小鼠分為6組,分別為正常對照組(Ⅰ組)、糖尿病腎病模型組(Ⅱ組)、模型+Se-76P低劑量組(Ⅲ組)、模型+Se-76P中劑量組(Ⅳ組)、模型+Se-76P高劑量組(Ⅴ組)和模型+胰島素治療組(Ⅵ組)。

1.2.2 試劑配制 pH4.5的檸檬酸緩沖液配制:A液(檸檬酸2.1 g 加入雙蒸水100 mL),B 液(檸檬酸鈉2.94 g 加入雙蒸水100 mL),用時A液和B液1∶1混合,調pH至4.5。STZ的配制:STZ用pH4.5的檸檬酸緩沖液配成50 mmol/L的濃度[8]。Se-76P的配制:分別取0.3、0.6和0.9 g的Se-76P蛋白溶于10 mL雙蒸水中,配成20、40和60 μmol/kg 三個濃度。胰島素配制:用生理鹽水配成0.5 U/mL。

1.2.3 糖尿病腎病模型建立 實驗前適應環境5 d,實驗第1 d,注射STZ前4 h,禁食不禁水,按40 mg/kg濃度腹腔注射STZ(每組現用現配)連續5 d,期間飲用10%蔗糖水。實驗第6 d,恢復為正常水(不用蔗糖水)。實驗第7 w,以上述給予STZ方法再次強化糖尿病模型(此次不給予蔗糖水),以維持STZ處理模型的高血糖。超過50%小鼠空腹血糖值>300～600 mg/dL(16.7～33.3 mmol/L)可判定為重度高血糖,成功獲得糖尿病腎病模型[9]。

1.2.4 實驗給藥 將造模成功小鼠隨機分入Ⅱ～Ⅵ組中,每組10只。各組小鼠均采用皮下注射方式給藥。Ⅰ組和Ⅱ組給予生理鹽水;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別給予低(20 μmol/kg)、中(40 μmol/kg)、高(60 μmol/kg)濃度Se-76P,每日1次;Ⅵ組給予5 U/kg·d胰島素,每日2次,各組連續給藥4 w,期間監測血糖和小鼠狀態。所有實驗動物末次給藥后,禁食不禁水12 h后,10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉,眼球取血,取腎組織。

1.3 小鼠體重變化

實驗期間按100 g/kg·d定量喂食,每周記錄體重,實驗結束后比較各組小鼠體重變化。

1.4 血清指標檢測

實驗結束后,小鼠眼球取血,3000 r/min離心5 min分離血清,測定空腹血糖值;試劑盒測定血清BUN和血清肌酐(serum creatinine,SCr)水平。

1.5 尿液指標檢測

實驗結束前,代謝籠中留取24 h尿液,試劑盒測定MAU和尿肌酐(urine creatinine,UCr)水平,并計算小鼠的肌酐清除率(creatinine clearance,CCr),CCr=UCr×[24 h尿量/(24 h×60 min)]/SCr/體重。

1.6 組織生化指標檢測

取腎組織稱重,按照1∶9比例加入的生理鹽水稀釋,4 ℃下將組織研磨成10%的勻漿組織,2500 r/min離心10 min,取上清液,試劑盒測定腎組織勻漿中SOD、MDA、GPx水平。

1.7 統計分析

2 結果與分析

2.1 體重變化

體重減輕是糖尿病常見癥狀,在較長時間內,監測糖尿病模型小鼠體重改變,可以在一定程度上反映藥物對糖尿病模型小鼠的治療效果。結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組小鼠體重在實驗第1 w和第2 w無明顯改變,而在第3 w和第4 w明顯降低(p<0.01或0.05);與Ⅱ組相比,Ⅲ組和Ⅵ組小鼠體重在實驗第3 w和第4 w明顯增加(p<0.01或0.05),而其他組無明顯差異(見圖1)。表明正常組小鼠體重隨時間延長而增加,而糖尿病腎病模型組小鼠體重隨時間延長增加不明顯,3 w開始體重增長明顯低于正常組小鼠,而注射Se-76P后,各劑量組小鼠體重隨時間延長而明顯增加,并在4 w左右開始,接近正常組小鼠,提示Se-76P能夠改善糖尿病腎病小鼠的體重。

圖1 各組小鼠體重改變Fig.1 Body weight changes in each group(n=10,±s)注:與正常組比較#p<0.05,##p<0.01;與模型組比較*p<0.05,**p<0.01;圖2、表1～表3同。

2.2 空腹血糖、SCr和BUN水平比較

結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組空腹血糖值明顯增高(p<0.01);與Ⅱ組相比,Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅵ組小鼠空腹血糖值明顯降低(p<0.01或0.05),而Ⅴ組雖然也降低,但無明顯差異(見圖2)。表明糖尿病腎病模型組小鼠空腹血糖值明顯高于正常組,而胰島素治療組空腹血糖值明顯低于模型組,Se-76P各劑量治療組中,低劑量組對空腹血糖的降低作用最為明顯,高劑量組雖然也顯示出降低空腹血糖的作用,但與模型組相比沒有明顯統計學差異,結果提示,Se-76P具有降低血糖的作用。

圖2 各組小鼠血糖改變Fig.2 Blood glucose changes in each group(n=10,±s)

研究表明血清中硒水平與糖尿病程度有相關性[10],2型糖尿病患者每天補充200 μg硒,可以明顯降低血清胰島素水平[11],人體硒的水平可以作為高血壓病人2型糖尿病早期預測標志物[12]。硒的降血糖機制可能與其胰島素樣作用相關,研究發現硒能夠通過Akt的激活以及p70 S6激酶等其他胰島素信號級聯激酶的激活產生胰島素樣作用[13],此外硒還可以抑制腸葡萄糖的轉運,加速腎糖排泄[14]。硒的降血糖作用也與其抗氧化作用有關,無論是有機還是無機的硒化合物都已經顯示出能通過減少氧化應激改善糖尿病的作用。但需要指出的是,并不是體內硒的劑量越高,降血糖效果越好,在一些研究中也顯示,體內硒的水平過高,反而可能與糖尿病風險的增加有相關性[3]。

SCr和BUN都是腎功能改變的重要指標[15],結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組SCr和BUN均明顯升高(p<0.05),與Ⅱ組相比,Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅵ組SCr和BUN水平顯著降低(p<0.01或0.05),而Ⅴ組雖然也降低,但無明顯差異(見表1),表明Se-76P各劑量治療組都在一定程度上,改善了降低了糖尿病腎病模型組小鼠的SCr和BUN水平。

表1 各組SCr和BUN水平比較Table 1 Comparison of levels of SCr and BUN

高血糖狀態下,增加的多元醇通路和蛋白激酶C的激活誘發了ROS的大量產生[16],ROS可使腎細胞DNA、蛋白、脂質等損傷,進而引起腎細胞功能改變,最終導致腎功能損傷[17]。抗氧化物能夠中和ROS,有效的阻止實驗誘導的糖尿病的發生,也能減少糖尿病腎病的損傷程度[18]。上述實驗結果提示,Se-76P對改善腎功能有明顯作用。

2.3 尿MAU、UCr和CCr水平比較

尿MAU及CCr是反映腎功能的最直接和最重要的兩個指標[15],糖尿病腎病時尿MAU升高,而CCr在糖尿病腎病早期升高,晚期降低。實驗結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組MAU、UCr和CCr均明顯升高(p<0.01),與Ⅱ組相比,Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅵ組MAU、UCr和CCr水平顯著降低(p<0.01或0.05),而Ⅴ組雖然也降低,但無明顯差異(見表2)。表明糖尿病腎病模型組小鼠表現出腎功能失調,而Se-76P各劑量組都可以改善糖尿病腎病模型組小鼠的尿MAU和CCr,提示Se-76P可以改善糖尿病腎病小鼠的腎功能。

表2 各組尿液中MAU、UCr及CCr的比較Table 2 Comparison of levels of MAU，UCr and CCr

2.4 腎組織SOD、MDA及GPx水平比較

糖尿病腎病的發生機制較為復雜,但多種機制都與氧化應激損傷密切相關[19-21]。SOD、MDA和GPx等都是反應機體氧化應激水平的重要標志。腎組織中SOD、MDA和GPx的檢測結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組SOD和GPx均明顯降低(p<0.05),而MDA水平明顯升高(p<0.01);與Ⅱ組相比,Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組和Ⅵ組SOD和GPx水平均顯著升高(p<0.01或0.05),而MDA水平則顯著降低(p<0.01或0.05)(見表3)。結果表明,糖尿病腎病模型小鼠的抗氧化指標SOD和GPx均明顯下降,而氧化損傷指標MDA水平升高,而Se-76P各劑量組都可以明顯的降低MDA水平,提高SOD和GPx水平,提示Se-76P可以通過抗氧化作用改善腎功能。

表3 各組腎組織SOD、MDA及GPx水平的比較Table 3 Comparison of levels of SOD，MDA and GPx in each group(n=10,±s)

研究表明,各種有機硒和無機硒都可以通過抗氧化作用改善糖尿病腎病的腎損傷程度。如亞硒酸鈉不僅能夠保護糖尿病誘導的氧化損傷[22],也能保護STZ誘導的大鼠的腎損傷[23];依布硒啉可以清除自由基,減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷[24];納米硒不僅能夠降低血糖,而且具有抗氧化作用,對STZ誘導的大鼠糖尿病腎病具有很好的保護作用[25],而這種抗氧化作用可能與Bax和Bcl-2的調控相關[26]。

體內的抗氧化酶GPx是一種硒蛋白,對保護細胞的氧化損傷具有重要的作用[27],糖尿病患者血清中硒的水平與GPx的抗ROS活性程度相關[28]。本實驗中使用的含硒76肽(Se-76P),是一種具有SOD和GPx雙酶活性中心的含硒多肽,同時具有很強的SOD和GPx活性。前期研究表明,Se-76P能通過減少線粒體的氧化損傷,而降低ROS、MDA、LDH、AST產生,從而保護肝細胞,這種作用可能與凋亡相關基因(Bad、Bax、Bcl-xL和Bcl-2)以及凋亡相關蛋白(caspase3和PARP)的調控相關[7]。因此有理由相信,Se-76P的改善腎損傷的抗氧化機制可能與上述凋亡基因或凋亡相關蛋白相關,具體機制仍需進一步研究。

3 結論

本實驗中模型組的SCr、UCr、BUN和MAU均較正常組明顯升高,提示模型組出現了腎功能失調,而Se-76P作用后,各劑量組均一定程度地降低了SCr、UCr、BUN和MAU水平,表明Se-76P對糖尿病腎病模型小鼠腎功能具有一定程度的改善作用。模型組小鼠腎組織中MDA升高,SOD和GPx均降低,表明模型組小鼠腎組織存在氧化應激損傷,抗氧化酶保護作用降低,而Se-76P作用后,SOD和GPx活性均顯著提高,MDA水平下降,表明Se-76P的抗氧化作用一定程度上改善了小鼠腎組織的氧化應激損傷。本實驗結果提示,Se-76P對糖尿病誘導的腎的生化改變具有改善作用,能降低糖尿病腎病發病風險,這種保護作用可能與Se-76P的抗氧化作用有關,但是Se-76P長期應用后可能的毒性作用以及具體的作用機制需要進一步研究。

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Effect of selenium Se-76P on STZ-induced renal function
and biochemical indexes in mice with diabetic nephropathy

LI Qiang1,TIAN Fu-jun2,WEI Zi-jing2,GE Xin2,HU Chao2,WANG Cheng3，*

(1.Department of Immune Technology,Laboratory Medical College of Jilin Medical University,Jilin 132013,China; 2.Department of Medical Imaging,Clinical Medical Sciences College of Jilin Medical University,Jilin 132013,China; 3.Department of Biochemistry,Basic Medical Sciences College of Jilin Medical University,Jilin 132013,China)

To explore the role and mechanism of selenium protein(Se-76P)on streptozocin-induced diabeticnephropathy in mice. Diabetic nephropathy model were prepared with streptozocin(40 mg/kg)by intraperitoneal injection in male C57BL/6J male mice. 60 mice were divided into six groups,normal control group(group Ⅰ),model of diabetic nephropathy group(group Ⅱ),model+low-dose Se-76P group(group Ⅲ),model+middle-dose Se-76P group(group Ⅳ),model+high dose Se-76P group(group Ⅴ)and insulin treatment group(group Ⅵ). Both groups of mice were administrated by subcutaneous injection way,group Ⅰ and group Ⅱ was given saline,group Ⅲ,Ⅳ and Ⅴwere given low(20 μmol/kg),middle(40 μmol/kg)and high(60 μmol/kg)concentration of Se-76P protein,group Ⅵ was given insulin,5 U/kg·d. All groups were treated for 4 weeks,and body weights were measured every week. After the experiment,blood glucose,serum creatinine(SCr)and urea nitrogen(BUN)levels were measured in serum. The urine creatinine(UCr)and microalbuminuria(MAU)levels were detected and the creatinine clearance(CCr)was calculated,renal tissue malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPx)levels were also detected. Compared with model group,fasting blood sugar were decreased in Se-76P administrated groups,the levels of SCr,BUN,UCr,MAU and CCr were significantly decreased(p<0.01 or 0.05). The MDA level was decreased in kidney tissues significantly(p<0.01),SOD and GPx activity were increased significantly(p<0.01 orp<0.05). Se-76P may improve renal function in STZ-induced diabetic nephropathy mice by increasing SOD and GPx activities,enhancing antioxidant levels.

selenoprotein;Se-76P;streptozocin;diabetic kidney disease

2016-12-12

李強(1979-)，男，博士研究生，講師，研究方向：炎癥機制，E-mail：liq1126@126.com。

*通訊作者:王程(1979-)，男，博士研究生，副教授，研究方向：分子模擬酶，E-mail：wangcheng10@mails.jlu.edu.cn。

吉林省科技廳自然科學基金項目(20150101131JC)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(吉教合字2015-405)；吉林省衛生廳科技計劃基金資助項目(2013ZC015)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0280-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.055