超聲波輔助堿處理增溶米渣蛋白工藝優化

潘 征,MIAO Song,3,沈凱青,蔡小華,張龍濤,3,*,鄭寶東(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，愛爾蘭科克市 999014)

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超聲波輔助堿處理增溶米渣蛋白工藝優化

潘 征1,2,MIAO Song1,2,3,沈凱青1,2,蔡小華1,2,張龍濤1,2,3,*,鄭寶東1,2
(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，愛爾蘭科克市 999014)

采用超聲波輔助堿處理提高米渣蛋白的溶解度。選擇反應溫度、超聲波時間、超聲波強度、蛋白濃度、NaOH濃度為優化因素,通過單因素和響應面分析,得到超聲波輔助堿處理增溶米渣蛋白最佳工藝條件為:反應溫度50 ℃、超聲時間60 min、超聲波強度19.2 W/cm2、米渣蛋白濃度5.1%(w/v)、NaOH濃度0.08 mol/L。在此條件下,改性后得到的米渣蛋白溶解度達(20.09±0.58) mg/mL(w/v)。SDS-PAGE結果表明蛋白的二硫鍵和亞基遭到破壞,處理過程中伴隨著一些不溶性蛋白聚集體的溶解,且蛋白平均粒徑由485 nm降低到223 nm,進而導致米渣蛋白溶解度顯著增加。這些結果表明超聲波輔助堿處理有助于進一步加工利用米渣蛋白,為食品的生產加工提供借鑒。

超聲波,堿處理,米渣蛋白,溶解度

稻米是發展中國家最重要的糧食作物之一,提供了世界50%以上的人口食物中35%～59%的熱量[1],同時也是主要的糧食加工原料之一。2011年數據顯示,我國水稻總產量為2.025億噸,居世界首位。稻谷加工過程中所產生大量的副產物——米渣,多以低廉的價格出售用于動物飼料,對其做進一步的開發利用較少。米渣作為一種優質的蛋白資源,其蛋白含量可達到50%以上,且氨基酸組成平衡,具有低過敏性及抗癌活性等特點[2-3]。從米渣中提取蛋白,作為新的蛋白原料在食品中使用,已有商業化產品,并由于其良好的營養價值而獲得消費者的青睞。其蛋白質組成主要是胚乳蛋白,由清蛋白(4%～9%)、鹽溶性球蛋白(10%～11%)、醇溶性谷蛋白(3%)和堿溶性谷蛋白(66%～78%)組成[4]。由于谷蛋白存在,導致其在中性條件下溶解度很低,繼而影響了其它功能特性,限制了米渣蛋白在食品生產上的廣泛應用。迄今,已有多篇采用物理方法或化學法改善米渣蛋白功能特性的報道,物理方法如熱液蒸煮[5]、高速混合[6]和高壓處理[7],化學方法有酶解[8]和酸法[9]等。

超聲波技術已經廣泛應用于食品加工中,具有安全可靠,費用低、作用時間短、對營養物質影響較小等優點[10]。Jambrak等的研究表明,頻率為20 kHz、功率600 W的超聲波處理大豆分離蛋白30 min能提高其溶解度[11]。Li等以米渣為原料,對米渣蛋白的超聲波輔助堿處理提取技術做了探索,研究表明,該方法提高了疏水性氨基酸含量,改變米渣蛋白的微觀結構,如顆粒的多孔性增多,粒徑減小,從而提高了提取率[12]。然而,未見利用超聲波輔助堿處理米渣提高蛋白溶解度的研究報道。

本文以從米渣中提取的食品級米渣蛋白商業產品為材料,以蛋白溶解度為主要指標,研究超聲波輔助堿處理對米渣蛋白溶解度的影響,并采用響應面法優化處理條件,可為制備高溶解度的米渣蛋白提供數據參考,提高米渣蛋白的附加值,同時為超聲波輔助堿處理技術在植物蛋白制備方面的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米渣蛋白粉 食品級,江蘇無錫金農生物科技有限公司;其它試劑 均為國產分析純。

SDS-PAGE試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;Scientz-950E超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;Allegra X-30R臺式冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特商貿有限公司;Nano ZS90激光粒度儀 馬爾文儀器有限公司;Bio-Rad 電泳儀 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性米渣蛋白的制備 準確稱取一定重量的米渣蛋白置于250 mL夾套燒杯中,分散于100 mL一定濃度的NaOH溶液中,攪拌10 min后,將夾套燒杯連接恒溫水槽,通過水循環使超聲過程料液溫度恒定在所設置的溫度。按所需參數設置好超聲波細胞破碎儀(20 kHz)的超聲波的強度,工作時間為1 s,間歇時間1 s。經過設定好的超聲波時間處理后,待樣品冷卻至室溫后,用2 mol/L鹽酸將溶液調至pH7.5,在10000×g,4 ℃條件下離心10 min,取上清液測量其溶解度。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 反應溫度對米渣蛋白溶解度的影響 采用1.2.1法制備米渣蛋白,固定反應條件為超聲波時間60 min、蛋白濃度5%、NaOH濃度0.08 mol/L、超聲波強度19.3 W/cm2,考察反應溫度(30、40、50、60、70 ℃)對米渣蛋白溶液溶解度的影響。

1.2.2.2 超聲波時間對米渣蛋白溶解度的影響 采用1.2.1法制備米渣蛋白,固定反應條件為反應溫度50 ℃、蛋白濃度5%、NaOH濃度0.08 mol/L、超聲波強度19.3 W/cm2,考察超聲波時間(30、45、60、75、90 min)對米渣蛋白溶液溶解度的影響。

1.2.2.3 蛋白濃度對米渣蛋白溶解度的影響 采用1.2.1法制備米渣蛋白,固定反應條件為反應溫度50 ℃、超聲波時間60 min、NaOH濃度0.08 mol/L、超聲波強度19.3 W/cm2,考察蛋白濃度(w/v,1%、3%、5%、7%、9%)對米渣蛋白溶液溶解度的影響。

1.2.2.4 NaOH濃度對米渣蛋白溶解度的影響 采用1.2.1法制備米渣蛋白,固定反應條件為反應溫度50 ℃、超聲波時間60 min、蛋白濃度5%、超聲波強度19.3 W/cm2,考察NaOH濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L)對米渣蛋白溶液溶解度的影響。

1.2.2.5 超聲波強度濃度對米渣蛋白溶解度的影響 采用1.2.1法制備米渣蛋白,固定反應條件為反應溫度50 ℃、超聲波時間60 min、蛋白濃度5%、NaOH濃度0.08 mol/L,考察超聲波強度(15.3、17.6、19.3、22.1、24.1 W/cm2)對米渣蛋白溶液溶解度的影響。

超聲能量是超聲波在機械作用過程中產生的能量,當超聲波穿過介質時,這種能量會有部分以熱能方式損失掉,使被超聲的液體發熱。因此,記錄溫度隨時間變化,可以用來估計聲能的大小,方程如下:

I=P/s,P=m·cp·(dT/dt)

其中,s是指所用超聲波變幅桿的直徑,m是指所超聲溶液的質量,cp為溶液比熱,dT/dt是指該曲線的斜率。加熱過程中溫度的升高可通過電子溫度計記錄,最終的超聲強度用W/cm2表示,意為每平方厘米探頭所能產的能量(W)。

1.2.3 Box-Behnken實驗優化超聲波輔助堿處理條件 在單因素的實驗基礎上,選取蛋白濃度、NaOH濃度和超聲波強度三個對溶解度影響較大的因素,應用Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken設計實驗，以溶解度作為響應值來確定其最優的處理條件。實驗設計水平見表1。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 The variables employed in the Box-Behnken design

1.2.4 溶解度的測定 蛋白溶解度參考Jambrak[11]的方法進行測定。以牛血清蛋白繪制標準曲線,為y=0.008x+0.003,相關系數R2=0.9999,計算上清液中蛋白含量。所有測量三次重復。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE參照LaemmLi[13]的方法進行測定。

1.2.6 粒徑的測定 蛋白的粒徑使用馬爾文粒度儀的動態光散射技術進行測定,測量溫度為25 ℃,散射角度90°。所有測量重復三次,取其平均值。

1.3 數據分析

以上實驗每個處理重復三次,結果取平均值。采用Microsoft Office 2007軟件進行數據制圖和統計分析。Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 反應溫度對米渣蛋白溶解度的影響 由圖1可知,蛋白溶解度隨溫度的升高而升高。溫度較低時,蛋白質溶解緩慢,當溫度大于30 ℃時,溶解度明顯增加,但繼續增高溫度溶解度增加緩慢,這可能因為高溫會破壞蛋白質結構[14],故選擇反應溫度為50 ℃左右較為合理。

圖1 反應溫度對米渣蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of temperature on the solubility of rice protein

2.1.2 超聲波時間對米渣蛋白溶解度的影響 由圖2可知,隨超聲波時間增加,其溶解度逐漸增加,當超聲波時間大于60 min時,其溶解度增長緩慢,出于節約時間成本考慮,選取超聲波時間為60 min進行后續實驗。

圖2 超聲波時間對米渣蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the solubility of rice protein

2.1.3 蛋白濃度對米渣蛋白溶解度的影響 如圖3所示,隨蛋白濃度的增加可溶性蛋白濃度呈現先上升后下降的趨勢。蛋白濃度在1%時,溶解度最低,為3.79 mg/mL;隨蛋白濃度的增加,在5%處達到最大值,為11.67 mg/mL。當蛋白濃度大于5%時,米渣蛋白溶解度呈下降趨勢。在預實驗中,當蛋白濃度大于9%,蛋白質成糊狀,流動性極差,這可能是由于在強堿性條件下,蛋白質發生變性,蛋白質分子聚集并形成有序的蛋白質網絡結構,蛋白溶液粘度較大,分子擴散速率較低,不利于超聲波的傳導,且分子間的相互斥力阻礙更多蛋白的溶出[15]。袁道強和楊麗的研究表明,當蛋白溶液質量濃度高于一定值時,由于蛋白質的凝膠化作用,形成了溶膠,此時的蛋白溶液已經不是以一種真溶液的形式存在,而是大的蛋白質分子伸展后和水相互作用,使蛋白質更穩定的分散在水中,同時蛋白伸展形成的網絡結構鎖住了水分,故不利于超聲波處理[16]。因此,確定5%的米渣蛋白濃度進行后續實驗。

圖3 蛋白濃度對米渣蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of protein concentration on the solubility of rice protein

2.1.4 NaOH濃度對米渣蛋白溶解度的影響 不同NaOH濃度對米渣蛋白溶解度的影響見圖4。從圖4中可知,NaOH濃度在0.02～0.08 mol/L時,米渣蛋白溶解度隨堿濃度的升高而升高,最大溶解度達到19.79 mg/mL。在堿濃度高于0.08 mol/L之后蛋白的溶解度下降。王濤等研究發現,堿處理可將蛋白質的結構展開,使內部的親水基團暴露在水溶液中,增強水與極性基團的相互作用,并將蛋白的部分亞基水解成低分子量的蛋白質[17]。堿處理一定程度上展開蛋白質的結構[18-19],使蛋白構象發生改變和解聚[14],超聲波輔助處理所產生劇烈水力空化作用使堿處理的作用加強,使不溶性蛋白在水中分散性提高[20]。因此確定以NaOH濃度為0.08 mol/L進行后續實驗。

圖4 NaOH濃度對米渣蛋白溶解度的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on the solubility of rice protein

2.1.5 超聲波強度對米渣蛋白溶解度的影響 超聲波強度對米渣蛋白溶解度的影響見圖5。由圖5可知,隨超聲波強度的增大可溶性蛋白溶解度呈先上升后下降的趨勢,在19.3 W/cm2處蛋白濃度達到最大值。王忠合等研究發現豌豆蛋白的溶解度隨超聲波強度的增大而增大[21],與本實驗結果一致。超聲波力空化瞬間產生極高的壓強和溫度[22-23],從而破壞蛋白質結構,極性基團暴露,導致水和蛋白質之間的相互作用增強,溶解度增大[24]。王濤等研究發現,冷凍粉碎輔助堿處理使米渣蛋白在pH12.5條件下的溶解度比未處理組增大42倍[17],其采用物理手段輔助提高堿處理提高蛋白質溶解度的結果與本研究類似。超聲波可以進一步提高堿處理的效果在Li等的研究中也得到證實,該處理可有效地破壞蛋白質的分子結構,使更多的蛋白質分子溶解到溶液中[12]。

表3 響應面實驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

圖5 超聲波強度對米渣蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on the solubility of rice protein

注:**為差異極顯著(p<0.01),*為差異顯著(p<0.05)。

2.2 米渣蛋白增溶工藝優化分析

以溶解度為檢測指標,通過單因素實驗,獲得合理的因素水平進行響應面實驗,以確定最佳的改性條件。Box-Benhnken實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計結果Table 2 Results of Box-Behnken design

方差分析結果如表3所示。使用軟件Design-Expert對數據進行擬合,獲得模型的二次多項回歸方程為:

R=19.56+0.51A+0.97B+1.11C-0.33AB-0.58AC+1.09BC-4.05A2-4.57B2-3.69C2

從表3可知,模型的決定系數R2=0.9929,由方差分析可知,模型的p<0.0001,模型極顯著,說明該模型與實際擬合良好,實驗方法可靠,失擬項p=0.2995,失擬項不顯著,說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小,可以用于對米渣蛋白增溶的工藝進行分析,并預測米渣蛋白溶解度隨各因素的變化規律。由F值可知各因素影響結果的主次順為C(超聲波強度)>B(NaOH濃度)>A(蛋白濃度)。A、B、C、A2、B2、C2和BC交互項具有極顯著性差異,AC交互項具有顯著性差異。

2.3 各因素交互作用分析

為了更直觀的找出最佳的工藝條件和分析各組因素間的交互作用,采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中實驗結果進行模型分析,并繪制響應面的曲線圖,見圖6。

圖6 兩因素的交互作用對米渣蛋白溶解度的響應面圖Fig.6 Response surface plots of variable parameters on the RRP solubility注:a:蛋白濃度和NaOH濃度對蛋白溶解度影響的等高線圖和三維曲面圖;b:超聲波強度和蛋白濃度對蛋白溶解度影響的等高線圖和三維曲面圖;c:超聲波強度和NaOH濃度對蛋白溶解度影響的等高線圖和三維曲面圖。

圖6(a)結合交互項的顯著性分析,可得出蛋白濃度和NaOH濃度兩者對溶解度的交互作用不顯著。圖6(b)表明,蛋白濃度<4% 時,蛋白濃度對溶解度產生的影響顯著,反之,蛋白濃度>4%,蛋白濃度對溶解度的產生影響逐漸減弱。等高線的輪廓呈現出斜向的橢圓形,說明超聲波強度和蛋白濃度之間具有良好的交互作用。從圖6(c)可知,超聲波強度和NaOH濃度兩者交互作用極顯著。

2.4 驗證實驗

通過響應面分析軟件Design Expert 8.0.6進行分析得到最優工藝條件,蛋白濃度5.09%、NaOH濃度0.08 mol/L、超聲波強度19.2 W/cm2時,預測米渣蛋白的溶解度為19.73 mg/mL。為驗證該條件是否可靠,結合實際操作,采用修正后的參數蛋白濃度5.1%、NaOH濃度0.08 mol/L、超聲波強度19.2 W/cm2,超聲波輔助堿處理米渣蛋白,重復實驗3次得到的溶解度的平均值為(20.09±0.58)mg/mL,相比于響應面模型在最佳工藝條件下的預期結果,與預測值接近,偏差較小。

2.5 SDS-PAGE

谷蛋白部分主要由酸性亞基(谷蛋白-AS 30～39 kDa)和堿性亞基(谷蛋白-BS 19～25 kDa)組成,在分子量為10 kDa處的蛋白可能為醇溶性谷蛋白[25]。從圖7可知,未經處理的米渣蛋白對照組的三條條帶大致分布在分子量為35、19和11 kDa處,與O’Sullivan研究中的米渣蛋白電泳圖條帶分布一致[26]。經過超聲波輔助堿處理后,各條帶變淡、消失,說明蛋白質的二硫鍵和亞基可能遭到破壞,形成易溶的小分子肽類物質,這可能也是米渣蛋白的溶解度增加的原因之一[14,20]。

圖7 蛋白的電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE profiles of proteins

2.6 粒徑的測定

蛋白質的粒徑很大程度上影響著其溶解度的大小[27]。由圖8可知,經超聲波輔助堿處理后,分散液中的米渣蛋白平均粒徑由485 nm降低到223 nm,其粒徑Ⅰ區和Ⅱ區分布圖明顯向左偏移,說明所有區間的顆粒粒徑均明顯變小。結合圖1～圖5溶解度增加的結論可推測,超聲波使米渣蛋白粒徑降低是蛋白的溶解度顯著提高的因素之一,與Li等的研究結論一致[28]。

圖8 蛋白粒徑的變化Fig.8 Effects of UAA treatment on protein’s size

3 結論

研究在單因素和響應面設計優化實驗基礎上,建立了米渣蛋白溶解度的回歸模型,由該模型得到米渣蛋白的最優增溶工藝條件:反應溫度50 ℃、超聲時間60 min、超聲波強度19.2 W/cm2、蛋白濃度5.1%、NaOH濃度0.08 mol/L。在此條件下,改性后得到的米渣蛋白溶解度最大,達到(20.09±0.58)mg/mL。SDS-PAGE結果表明蛋白的二硫鍵和亞基遭到破壞,處理過程中伴隨著一些不溶性蛋白聚集體的溶解,且其平均粒徑由485 nm降低到223 nm,進而導致可溶性蛋白粒徑下降,使米渣蛋白溶解度顯著增加。

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權威·核心·領先·實用·全面

Process optimization of increase the solubility of rice residue protein by ultrasound-assisted alkali treatment

PAN Zheng1,2,MIAO Song1,2,3,SHEN Kai-qing1,2,CAI Xiao-hua1,2,ZHANG Long-tao1,2,3,*,ZHENG Bao-dong1,2

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.China-Ireland International Cooperation Center for Food Material Science and Structural Design,Fujian 350002,China; 3.Teagasc Food Research Centre,Moorepark,Fermoy,Co. Cork 999014,Ireland)

This study was to improve the solubility of rice residue protein(RRP)with ultrasound-assisted alkali treatment(UAA). The process parameters,including reaction temperature,ultrasoinc time ultrasonic intensity,protein concentration and NaOH concentration,were optimized with single factor test firstly and then optimized using response surface methodology. The optimized treatment condition were reaction temperature 50 ℃,ultrasonic time 60 min,ultrasonic intensity 19.2 W/cm2,protein concentration 5.1% and NaOH concentration 0.08 mol/L,the RRP solubility was improved to be(20.09±0.58)mg/mL. Results of SDS-PAGE showed that the disulfide bond and subunit of RRP were subjected to destruct,the insoluble protein aggregates was dissolved by the UAA treatment. Determination of particle size showed that the protein size decreased significantly from 485 nm to 223 nm. All above attributed to the solubility improvement. These results indicated that UAA treatment was beneficial for promoting RRP processing techniques,it might be a promising manufacturing technique in food industry.

ultrasound;alkali treatment;rice protein;solubility

2017-02-07

潘征(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：392903095@qq.com。

*通訊作者:張龍濤(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品材料與結構設計，E-mail：zlongtao@hotmail.com。

TS210.1

B

1002-0306(2017)14-0232-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.045