姬松茸深層發酵多糖提取工藝優化及抗氧化活性

任朝輝,馮國輝,張傳博(貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001)

?

姬松茸深層發酵多糖提取工藝優化及抗氧化活性

任朝輝,馮國輝,張傳博*
(貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001)

姬松茸,響應面法,多糖,提取,抗氧化活性

姬松茸(AgaricusblazeiMurrill)又稱巴西蘑菇,屬擔子菌門、蘑菇科、蘑菇屬,是一種藥食兼備的珍稀食用菌類,營養豐富,子實體脆嫩鮮美,具杏仁香味,食用價值頗高。姬松茸多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、護肝、提高免疫調節等多種生物學活性與藥理功能[1-2]。具文獻報道,姬松茸發酵菌絲體多糖和子實體多糖具有相似的藥理活性[3],與姬松茸子實體栽培的方法相比較,采用液態深層發酵培養姬松茸菌絲體具有生產周期短、成本低、不受季節及氣候的影響、可以大規模工業化生產等優勢[4]。以液態深層發酵菌絲體提取多糖替代子實體多糖是姬松茸產業發展需求,具有廣闊的開發利用前景與科學意義。

多糖是一種極性大分子化合物，真菌多糖通常采用熱水浸提法,該方法簡單方便、成本低、適合于大規模的工業化生產、不會引起多糖降解等優點,但提出的多糖主要是胞外多糖,因而,多糖提取率較低[5]。隨著多糖提取技術的發展,近年來逐步出現了超聲波法、酶法以及微波法等輔助提取方法,大大縮短了提取時間,同時也提高了多糖的提取率[6-10]。近年來主要對姬松茸多糖的熱水浸提法進行研究，具文獻報道,先采用超聲波破壁處理后再用熱水浸提的方法可以提高多糖的提取率,但超聲波處理時間不宜過長[11]。本實驗以液體深層發酵培養的姬松茸菌絲體為材料,采用超聲波輔助熱水浸提法提取姬松茸多糖,在單因素實驗的基礎之上,運用響應面統計分析軟件優化多糖提取工藝,并進行抗氧化活性檢測,為開發利用姬松茸多糖相關產品,改進多糖高效制備工藝,拓展姬松茸的應用領域,提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姬松茸(AgaricusblazeiMurrill) 貴州師范大學微生物重點實驗室保藏菌種;原種培養基、液體種子培養基 均為PDA培養基;液體發酵培養基 玉米粉30 g,豆餅粉3 g,葡萄糖20 g,酵母膏3 g,KH2PO42 g,MgSO4·5H2O 0.2 g,鹽酸硫胺素(VB1)100 mg,蒸餾水1000 mL,pH自然;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;玉米粉、豆餅粉 市售;苯酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、維生素C、硫酸亞鐵、水楊酸、H2O2、葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·5H2O、VB1、濃硫酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇等 均為國產分析純。

JA2003N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;752E紫外可見光分光光度計 天津普瑞斯儀器有限公司;TD6低速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;DH6000B電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特有限公司;TS-2102雙層恒溫搖床 上海夢藍儀器設備有限公司;DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;RE-5286A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;超聲波儀 上海生析超聲儀器有限公司;SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 HIRAYAMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 深層液體發酵 將活化好的斜面菌種用接種鏟切割成黃豆大小的菌絲塊,接種于搖瓶種子培養基中,25 ℃,150 r/min振蕩培養4 d后以10%的接種量轉接500 mL發酵瓶,每瓶液體量為200 mL,25 ℃、150 r/min振蕩培養7 d。

1.2.2 多糖提取 發酵液經3500 r/min離心10 min收集姬松茸發酵菌絲體,用蒸餾水反復洗滌,去除殘余的培養基,60 ℃烘干,將菌絲體研磨粉碎,過60目篩。

稱取一定量的菌絲體粉末,以一定的加水量、提取溫度、提取時間、提取次數在恒溫水浴鍋中保溫提取,離心過濾并收集濾液,濃縮得多糖溶液。

1.2.3 多糖去蛋白處理與醇沉 Sevag法去除多糖溶液中的蛋白,重復除蛋白3次。合并多糖,旋轉真空濃縮至無油狀物漂浮液面即得多糖濃縮液[12]。向裝有已知體積的多糖濃縮液的燒杯中加入3倍體積的95%乙醇,靜置過夜(有絮狀物質析出),3500 r/min離心10 min,將沉淀物置于電熱恒溫干燥箱內45 ℃干燥至恒重得姬松茸多糖。

1.2.4 多糖得率分析 準確稱取一定質量的姬松茸多糖,加水溶解后定容到一定體積,分別測定總糖含量和還原糖含量。總糖含量測定:采用硫酸-苯酚法[13],以干燥至恒重的葡萄糖配制標準液,于490 nm波長處測定吸光度,繪制標準曲線,得葡萄糖對照品溶液的回歸方程:y=0.4554x+0.0001,其相關系數R2=0.9999。還原糖含量測定采用DNS法[14]。

多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

多糖得率(%)=多糖含量/菌絲體原料重量×100

1.2.5 姬松茸菌絲體多糖提取單因素實驗 稱取1.0 g姬松茸菌絲體粉末于圓底燒瓶中,以姬松茸菌絲體粗多糖得率為指標,考察提取溫度、提取時間、料液比及提取次數對姬松茸菌絲體多糖得率的影響,每組實驗重復3次。

提取溫度:設定回流時間2 h,料液比1∶30 g∶mL,提取1次,分別設定溫度80、85、90、95、100 ℃回流提取。

提取時間:溫度為90 ℃,料液比1∶30 g∶mL,提取1次,分別回流提取1、1.5、2、2.5、3 h。

料液比:設定提取溫度為90 ℃,回流提取2 h,提取1次,按料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g∶mL)。

總提取次數:提取溫度為90 ℃,回流提取2 h,料液比為1∶30 g∶mL,回流總提取次數分別為1、2、3、4、5次。

1.2.6 Box-Benhnken的中心組合實驗設計 在單因素實驗的基礎上,以姬松茸菌絲體多糖得率為響應值,考察提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)以及提取次數(D)為實驗因素,設計四因素三水平Box-Benhnken中心組合實驗,對姬松茸菌絲體多糖提取工藝進行優化研究(表1)。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.7 姬松茸多糖抗氧化活性檢測

1.2.7.1 清除DPPH自由基測定 以95%乙醇為溶劑,配制濃度為1×10-4mol/L DPPH自由基溶液。加入不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL)的姬松茸多糖溶液各1.0 mL,3 mL DPPH溶液,使總體積為4 mL,搖勻。混勻后于28 ℃恒溫30 min,在517 nm吸光值為A值[15-16],即為AX。向3 mL DPPH溶液中加入1 mL蒸餾水,記錄吸光值為A空白值(A0),即為空白對照;以3 mL 95%乙醇溶液,不同濃度的姬松茸多糖溶液各1.0 mL作為樣品組(AX0),每個濃度組平行測定3次,求其平均值;以VC作為陽性對照。測定結果以清除率(%)表示,計算公式如下:

1.2.7.2 清除·OH自由基測定 采用Fronton反應體系方法[17],在試管中加入9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,加入不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL)的姬松茸多糖溶液各1.0 mL,立即混勻,最后加入8.8 mmol/L的過氧化氫溶液1 mL開始反應,37 ℃反應30 min,在510 nm下測量吸光度(AX),以等體積的蒸餾水作為空白對照(A0)。以9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,不同濃度的姬松茸多糖溶液各1 mL和1 mL蒸餾水代替過氧化氫混勻后作為本底吸收值(AX0)。每個濃度組平行測定3次,求其平均值;以VC作為陽性對照組。測定結果以清除率(%)表示,計算公式如下:

1.2.8 數據處理 利用Design-Expert 8.0統計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析,再利用該軟件中響應面值優化程序求得當響應面值最大時各因素的最優組合。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對姬松茸多糖得率的影響 當溫度在80～90 ℃范圍內,隨著提取溫度的增加,多糖得率增加迅速;當溫度在90～100 ℃范圍內,隨著提取溫度的增加,曲線變得平坦,多糖得率緩慢降低(圖1),這可能是溫度過高(大于90 ℃)導致多糖被降解所致,因此,提取溫度選擇85、90、95 ℃作為中心組合實驗的三個水平。

圖1 溫度對姬松茸多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

2.1.2 時間對姬松茸多糖得率的影響 最初,隨著提取時間的延長,多糖得率逐漸增加;2 h后,隨著提取時間的延長,多糖得率緩慢降低(圖2),可能是由于長時間的高溫條件使多糖被破壞或原料中其他物質被提取出來,所以浸提時間不宜過長。因此,提取時間選擇1.5、2、2.5 h作為中心組合實驗的三個水平。

圖2 時間對姬松茸多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

圖3 料液比對姬松茸多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

2.1.3 料液比對姬松茸多糖得率的影響 當料液比在1∶20～1∶30 g∶mL范圍內,隨著提取料液比的增加,多糖得率增加迅速;當料液比在1∶30～1∶40 g∶mL范圍內,隨著提取料液比的增加,曲線趨于平坦,多糖得率幾乎沒有增加,并有緩慢降低的趨勢(圖3);這是因為當料液比較小時,隨著水量增多有利于多糖的溶出與擴散,多糖的得率隨之增大;但過高的料液比會導致原料中其他水溶物的溶出,抑制了多糖的提取。因此,提取料液比選擇1∶25、1∶30、1∶35 g∶mL作為中心組合實驗的三個水平。

2.1.4 次數對姬松茸多糖得率的影響 當總提取次數為1次時,多糖得率比較低;隨著提取次數的增加,多糖得率也隨之增大;當總提取次數在2～4次范圍時,多糖得率曲線基本趨于平坦,并有下降的趨勢;當總提取次數為5次時,多糖得率有明顯的下降趨勢,考慮到后期多糖溶液濃縮困難以及節省能源,因此,提取次數選擇1、2、3次作為中心組合實驗的三個水平。

圖4 次數對姬松茸多糖得率的影響Fig.4 Effect of times on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

圖4 次數對姬松茸多糖得率的影響Fig.4 Effect of times on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

2.2 響應面優化實驗

在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Benhnken設計原理,以溫度、時間、料液比和次數4個因素為自變量,姬松茸多糖得率為響應值,采用響應面法進行四因素三水平的響應面分析,研究各因素對姬松茸多糖得率影響的顯著性和各因素的最佳組合。共包括29組實驗方案,實驗設計方案及實驗結果見表2,ANOVA分析見表3。

表2 姬松茸多糖得率的響應面法設計方案及實驗結果Table 2 Response surface design arrangement of the yield ofAgaricus blazei Murrill polysaccharides and experimental results

2.2.1 擬合模型方程的建立與方差分析 通過統計分析軟件Design-Expert 8.0對表2中的數據進行多元回歸擬合分析,建立二次響應面回歸模型,并獲得多糖得率(Y)的二次多項回歸方程如下:

Y=9.07+0.42A+0.051B+0.035C+0.15D-0.082AB+0.062AC+0.38AD+0.1BC-2.5×10-3BD-0.06CD-0.43A2-0.15B2+0.023C2-0.26D2

該回歸模型方程ANOVA分析結果表明(表3):提取溫度A、提取次數D、交互因素AD(即提取溫度和提取次數交互作用)、提取溫度的二次項A2、提取時間的二次項B2、提取次數的二次項D2的p值均小于0.01,說明這些因素對姬松茸多糖得率有極顯著的影響;其他因素的p值均大于0.05,說明無顯著影響[21]。由此得出4個因素對姬松茸多糖得率的影響程度由大到小依次為:溫度(A)>次數(D)>時間(B)>料液比(C)。

表3 響應面對多糖得率的ANOVA分析Table 3 ANOVA analysis of response surface on the yield of polysaccharides

圖5 兩因素交互作用對姬松茸多糖得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of operating parameters on the yield of Agaricus blazei Murrill polysaccharides

注:**為差異性極顯著,p<0.01;*為差異性顯著,p<0.05。

2.2.2 響應面分析 通過回歸方程繪制該模型的響應面分析圖,如圖5所示;根據響應面實驗的設計原理及分析,三維響應面圖彎曲度越大,表示兩因素間顯著性差異越明顯,由此能有效的反映出各因素之間的交互作用對響應值多糖得率的影響[22]。從圖5中的6組三維圖可知:提取溫度(A)和提取次數(D)兩因素之間的交互作用對姬松茸多糖得率影響具有極顯著性差異,其他因素兩兩之間的交互作用對姬松茸多糖得率影響不顯著。

2.2.3 響應面優化提取工藝條件驗證 從圖5可以看出,6組三維響應面圖均開口向下,隨著兩個交互因素值的增加,多糖得率呈現先上升后下降的趨勢,說明在這些因素中必然存在一個最佳的組合使得姬松茸多糖得率達到最大值。在所選實驗因素范圍內,對響應面法實驗設計結果進行優化分析,通過對回歸模型求解方程,得出姬松茸多糖的最優提取工藝條件:溫度94 ℃、時間2.1 h、料液比1∶35 (g∶mL)、次數3次,此時多糖得率為9.30%,模型預測值為9.41%,模型預測值與實際測得值相比,其相對誤差為1.17%,說明本實驗建立的二次多項回歸方程能夠有效的反應各因素對姬松茸多糖得率的影響,同時也證明了用響應面法優化姬松茸多糖得率回歸方程模型是可行的。

2.3 姬松茸多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1 姬松茸多糖對DPPH自由基清除能力 DPPH法是一種檢測天然產物抗氧化活性的常用方法[23],操作簡單、重復性好、經濟可靠。從圖6可以得知,姬松茸多糖對DPPH自由基具有一定的清除能力;在測定的質量濃度范圍內,姬松茸多糖對DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增強,但在相同質量濃度時,姬松茸多糖清除率顯著低于VC,其中IC50分別是0.184 mg/mL和0.012 mg/mL;在質量濃度為0.1 mg/mL時,姬松茸多糖對DPPH自由基的清除率僅為26.9%,而VC的清除率高達94.2%。

圖6 姬松茸多糖對DPPH自由基的清除率Fig.6 Effect of Agaricus blazei Murrill polysaccharides on DPPH free radical scavenging

2.3.2 姬松茸多糖對·OH自由基清除能力 清除羥自由基的實驗原理是根據Fronton反應,該方法操作簡單、重復性好等優點,常用于醫學及分子生物學領域測定天然產物的抗氧化活性[24]。從圖7可知,姬松茸多糖對·OH自由基具有一定的清除能力;在測定的質量濃度范圍內,姬松茸多糖對·OH自由基的清除能力隨著質量濃度的增加而增強;在相同質量濃度時,姬松茸多糖對·OH自由基的清除率顯著低于VC,其中IC50分別是0.316 mg/mL和0.075 mg/mL。

圖7 姬松茸多糖對·OH自由基的清除率Fig.7 Effect of Agaricus blazei Murrill polysoccharides on hydroxyl free radical scavenging

圖8 姬松茸多糖對超氧陰離子自由基的清除率Fig.8 Effect of Agaricus blazei Murrill polysaccharides on superoxide anion free radical scavenging

2.3.3 姬松茸多糖對超氧陰離子自由基清除能力 利用鄰苯三酚自氧化測定天然產物的抗氧化活性,該方法靈敏度高、反應時間短。從圖8可知,姬松茸多糖對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力;在測定的質量濃度范圍內,隨著姬松茸多糖質量濃度的增加,對超氧陰離子自由基的清除能力也增強,在整個測定的質量濃度范圍內,姬松茸多糖對超氧陰離子自由基的清除率都要低于VC,其中IC50分別是0.198 mg/mL和0.036 mg/mL。

3 結論

采用超聲波輔助熱水浸提姬松茸多糖,具有提取條件溫和、提取率高、多糖活性好等優點[25]。在單因素實驗的基礎之上,以姬松茸多糖得率為響應值,經響應面法優化后,得到姬松茸多糖的最優提取工藝條件:溫度94 ℃、時間2.1 h、料液比1∶35(g∶mL)、次數3次;在此條件下姬松茸多糖的得率為9.30%,與預測值基本相符,說明經響應面優化的實驗條件具有實際意義;同時,也表明該模型設計合理,對姬松茸多糖的最優提取工藝具有現實指導作用。

[1]Wang H,Li G,Zhang W,et al. The protective effect ofAgaricusblazeiMurrill,submerged culture using the optimized medium composition,on alcohol-induced liver injury[J]. Biomed Research International,2014:573978.

[2]Liu Y,Zhang L,Zhu X,et al. PolysaccharideAgaricusblazeiMurill stimulates myeloid derived suppressor cell differentiation from M2 to M1 type,which mediates inhibition of tumour immune-evasion via the Toll-like receptor 2 pathway[J]. Immunology,2015,146(3):379-391.

[3]孫培龍.姬松茸多糖的分離純化、結構鑒定及抗腫瘤活性研究[D].浙江:浙江大學,2007.

[4]趙永勛.食藥用菌液體發酵的現狀和展望[J].農業與技術,2004,24(3):111-114.

[5]方積年,丁侃.天然藥物——多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國天然藥物,2007,5(5):338-347.

[6]李堆淑.超聲提取細黃鏈霉菌胞外多糖工藝與抗氧化活性研究[J].食品發酵與工業,2016,42(5):253-258.

[7]洪勝,潘利華,羅建平.生物多糖超聲波輔助提取研究進展[J].食品工業科技,2011,32(8):481-484.

[8]閆培生,馬麗雅,朱國振,等.荷葉離褶傘液體發酵及生物酶法提取菌絲體多糖的研究[J].中國農業科技導報,2010,12(4):84-89.

[9]張雖栓,李延磊,高誠偉.響應曲面法優化裂褶菌多糖的微波輔助提取工藝研究[J].河南農業大學學報,2014,48(4):449-454.

[10]阿燕.真菌胞內多糖提取方法的研究進展[J].微生物學雜志,2011,31(5):82-86.

[11]鄧巖,張英華.物理波強化提取金針菇多糖[J].現代化農業,2001(6):22.

[12]劉翠.姬松茸多糖的提取純化及注射液的研制[D].長春:吉林農業大學,2007.

[13]楊林,劉翠花,劉剛,等.西藏野生蕁麻水溶性多糖提取工藝的優化設計[J].食品工業,2013,34(2):35-37.

[14]張維杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,1994:13-14.

[15]李燮聽,蒲彪.錦橙皮膳食纖維抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2010,31(3):166-168.

[16]韋獻雅,殷麗琴,鐘成,等.DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學,2014,35(9):317-322.

[17]劉靜,李湘利,張艷,等. 響應面法優化提取香椿葉總膳食纖維的工藝條件及其抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2014(5):182-187.

[18]張文軍,葛超.NBT光還原法、鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活性的比較(簡報)[J].河北職業技術師范學院學報,2000,14(2):68-70.

[19]于金威.姬松茸菌液體發酵及其多糖活性研究[D].長春:吉林大學,2010.

[20]程振玉,宋海燕,楊英杰,等.不同提取方法對北五味子多糖提取率的影響[J].湖北農業科學,2015,54(1):159-163.

[21]周曉明,閆鵬,馬凱,等.響應面法優化超聲波輔助提取瑪咖總黃酮的工藝研究[J].新疆農業科學,2012,49(8):1414-1420.

[22]王永菲,王成國.響應面法的理論與應用[J].中央民族大學學報(自然科學版),2005,14(3):236-240.

[23]韋獻雅,殷麗琴,鐘成,等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學,2014,35(9):317-322.

[24]楊芬,張瑞萍,賀玖明,等.羥自由基的產生、捕集及檢測方法[J].藥學學報,2007,42(7):692-697.

[25]Raza A,Li F,Xu X,et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapa quadrispinosa using response surface methodology[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2017,94:335-344.

Optimization of extraction technology and antioxidant activity determination of polysaccharide from submerged fermentation mycelium inAgaricusblazeiMurrill

REN Chao-hui,FENG Guo-hui,ZHANG Chuan-bo*

(Shool of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

AgaricusblazeiMurrill;response surface methodology;polysaccharides;extraction;antioxidant activity

2016-12-14

任朝輝(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：真菌次生代謝產物，E-mail：1247560652@qq.com。

*通訊作者:張傳博(1976-)，男，博士，教授，研究方向：真菌次生代謝產物，E-mail：Zhangchuanbo2004@163.com。

貴陽市：2012現代農業與農村科技計劃(筑科合同[2012102]2-3-2)；貴州省林業廳育林基金(黔林科合[2012]08號)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)14-0216-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.042