四種蛋白酶酶解對樺褐孔菌多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

佟世生,胡錦榮,張京聲,董文霞,王 麗,劉 萍,*(.北京城市學院生物醫藥學部,北京 00094;.中國農業大學食品與營養工程學院,北京 00083)

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四種蛋白酶酶解對樺褐孔菌多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

佟世生1,胡錦榮2,張京聲2,董文霞2,王 麗2,劉 萍2,*
(1.北京城市學院生物醫藥學部,北京 100094;2.中國農業大學食品與營養工程學院,北京 100083)

為了探究樺褐孔菌高溫水提粗多糖(High temperature water-extracted polysaccharides,HIOP)中結合蛋白質組成鍵型與其α-葡萄糖苷酶抑制活性的關系，用4種不同的蛋白酶對HIOP進行酶解,測定蛋白酶水解后對其分子量組成及α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。結果顯示,與原HIOP在10 μg/mL時的α-葡萄糖苷酶抑制率83.72%相比,經中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解處理后的HIOP,α-葡萄糖苷酶抑制率最低分別為53%、65%、6.5%和7.1%,其中胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解處理顯著降低了HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性,表明HIOP中結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中有一定作用。結合四種蛋白酶的作用效果與作用鍵型推測,HIOP中結合蛋白的活性中心可能含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸、賴氨酸或精氨酸,破壞此類肽鍵,α-葡萄糖苷酶抑制活性明顯降低,而四種蛋白酶酶解均未使HIOP分子量發生較大改變,說明四種蛋白酶酶解僅影響了HIOP與α-葡萄糖苷酶活性中心結合的部位。

樺褐孔菌粗多糖,蛋白酶,α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制劑多被用于糖尿病的日常血糖控制,其通過抑制位于小腸的α-葡萄糖苷酶,使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢,從而減緩腸道內葡萄糖的吸收,降低餐后高血糖的升高[1-3]。目前常見的藥物為阿卡波糖,已廣泛應用于臨床[4]。但阿卡波糖在抑制α-葡萄糖苷酶活性的同時,會引發腸道不適等副作用[5],有一定的局限性。因此開發高效低副作用的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑是非常重要的。目前許多研究表明一些天然產物對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用。李朝暉等[6]發現,從枸杞子中提取的多糖能夠抑制消化道內α-葡萄糖苷酶的活性,有良好的降血糖作用。張鐘等[7]研究發現,荔枝果肉水溶性多糖對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用,且其抑制效果是阿卡波糖的1.25倍。

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制率反應體系Table 1 Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase

樺褐孔菌(Inonotusobliquus),又稱白樺茸(Chaga),是生長于白樺樹上的真菌。它主要分布在北緯45～50°的地區,如北美北部、芬蘭、俄羅斯、中國黑龍江、吉林省長白山地區等。目前國內外對于樺褐孔菌的研究發現樺褐孔菌多糖具有抗免疫、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理作用[8-13]。俄羅斯Komsomlshi制藥公司還發現樺褐孔菌精粉對糖尿病的治愈率為93%[14],可以修復已損壞的β-細胞[15-17]。本實驗前期研究發現,樺褐孔菌高溫水提粗多糖(High temperature water-extracted polysaccharides,HIOP)對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用,其中10 μg/mL的HIOP對α-葡萄糖苷酶抑制率高達83.72%,而阿卡波糖在1000 μg/mL時,α-葡萄糖苷酶抑制率也僅為27.03%。因此HIOP具有成為一種新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛力。而眾所周知,多糖分子的結構進行適當修飾可以顯著增強其生物活性[18-20]。因此對HIOP分子結構的研究非常必要。前期實驗中發現HIOP中含有一定量的結合蛋白,而結合蛋白在樺褐孔菌多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性中是否有作用無法確定。因此本文分別使用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶四種不同的蛋白酶對HIOP進行酶解處理。以HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性和大分子物質組成的變化為主要測定因素,對HIOP 中的結合蛋白對其α-葡萄糖苷酶抑制活性及分子組分變化進行了初步的研究,為藥物的開發與利用提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌高溫水提粗多糖(HIOP) 本實驗室前期分離,北京藍弋化工有限公司:中性蛋白酶(60000 U/g)、堿性蛋白酶(1000000 U/g) 美國Sigma公司:胃蛋白酶(800 U/g)、胰蛋白酶(250000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(釀酒酵母)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) 美國Corning公司;96孔酶標板。

TGL-16C離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1810紫外分光光度計 上海棱光科技有限公司;M200 pro多功能酶標儀 Tecan集團奧地利有限公司;1260 Infinity凝膠滲透色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解處理 實驗組:向濃度為10 mg/mL的50 mL HIOP溶液中分別添加中性蛋白酶溶液、堿性蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液(四種酶均配為酶活大小為1000 U/mL),按照總反應體系的1%、2%、3%、4%、5%的體積百分數,添加量為500、1000、1500、2000、2500 U/mL;對照組:在50 mL水溶液中(與10 mg/mL的HIOP溶液等體積),再添加與實驗組相同量的酶溶液。在酶的最適條件下酶解3 h后,于100 ℃下水浴加熱10 min,使其中的酶充分滅活。酶解多糖液8000 r/min離心10 min去除沉淀后,稀釋酶解多糖溶液使其多糖濃度為10 μg/mL,測定實驗組與對照組的α-葡萄糖苷酶抑制率。實驗中以未經任何處理的10 μg/mL HIOP為空白組。

1.2.2 酶解后分子組成變化 使用凝膠滲透色譜(GPC)法測定酶添加量5%所得酶解糖液的分子量組成變化[21-23]。色譜條件:色譜柱,Waters UllrallydrogelTM Linear(規格為7.8 mm×300 mm);檢測器,Waters 2410示差折光檢測器;流動相,0.1 mol/L NaNO3溶液;流速,0.9 mL/min;柱溫,45 ℃。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制率測定 使用96孔酶標板進行α-葡萄糖苷酶抑制率的測定[24-25]。吸取pH6.8的磷酸鹽緩沖液60 μL和待測樣品溶液20 μL置于96孔板上,加入2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL,混勻后于37 ℃反應10 min,再加入5 mmol/L的PNPG溶液20 μL,混勻,于37 ℃繼續反應10 min,最后加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液30 μL調節反應體系的pH至堿性,終止反應。具體反應體系如表1所示。使用酶標儀,測定405 nm波長處的吸光度值,根據以下公式,計算抑制率R。

式中:A1為樣品溶液組的吸光度;A2為樣品對照組的吸光度;A3為對照組溶液的吸光度;A4為空白對照組溶液的吸光度。

1.2.4 數據處理 實驗中每個處理重復三次,采用Origin8.0作圖分析。

2 結果與分析

2.1 中性蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性及組分的影響

從圖1可以看出,經中性蛋白酶酶解處理后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率下降,其中在中性蛋白酶酶濃度為500 U/mL時,經酶解后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率由原來83.72%降至52.58%,但酶濃度為500～1500 U/mL時,酶解處理后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率變化不明顯。其中,在酶濃度較高(2000～2500 U/mL)時,經酶解后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率出現小幅度回升現象,但抑制率仍明顯低于未經酶解處理的HIOP。推測可能是大量酶液的添加使得反應體系中產生了顏色疊加現象,從而影響了實驗結果的測定,使得測定的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率出現回升現象。

圖1 中性蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 Effect of neutral protease hydrolysis on α-glucosidase inhibitory rate of HIOP

中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經發酵提取而得的,屬于一種內切酶。在50 ℃、pH6.0～7.5的條件下,能將大分子蛋白質水解為氨基酸等產物。從圖1中可以看出,經中性蛋白酶酶解后,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率出現下降現象,推測可能是中性蛋白酶水解了HIOP中的結合蛋白,從而使其α-葡萄糖苷酶抑制率降低。說明HIOP中的結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中有一定的作用。進一步研究中性蛋白酶酶解對HIOP組分及分子量大小的影響,結果見圖2,從圖2中可以看出，實驗組與未經酶解處理后的空白組相比,峰值的保留時間并沒有發生改變。說明中性蛋白酶酶解處理對HIOP的分子量大小及組成并沒有產生影響,因此推測中性蛋白酶處理可能只是對HIOP的生物活性中心的結構產生了影響。

圖2 中性蛋白酶酶解對HIOP物質的影響Fig.2 The effect of neutral protease on composition of HIOP 注:1-0為對照組;1-1為實驗組; 1-2為空白組;圖4、圖6、圖8同。

2.2 堿性蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性及組分的影響

從圖3可以看出,經堿性蛋白酶酶解處理后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性出現了少量下降,堿性蛋白酶酶濃度為500～1000 U/mL時,酶解后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率從未經酶解前的83.72%降至65%左右。而在酶濃度為(1500～2500 U/mL)時,發現經酶解后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率出現小幅度回升現象,但抑制率仍明顯低于未經酶解處理的HIOP。推測可能是大量酶液的添加使得反應體系中產生了顏色疊加現象,從而影響了實驗結果的測定,使得測定的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率出現回升現象。

圖3 堿性蛋白酶酶解對HIOP的 α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.3 Effect of alkaline protease hydrolysis on α-glucosidase inhibitory rate of HIOP

堿性蛋白酶是經細菌原生質體誘變方法培育的2709枯草桿微生物通過深層發酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶,是一種內切酶。在40～55 ℃、pH9～11堿性條件下能水解蛋白質分子肽鏈生成多肽或氨基酸,具有較強的分解蛋白質的能力[26]。從圖3中可以看出,堿性蛋白酶酶解處理后,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率下降,推測可能是堿性蛋白酶水解了HIOP中的結合蛋白,從而使其α-葡萄糖苷酶抑制率降低,說明HIOP中的結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中有一定的作用。進一步研究堿性蛋白酶酶解對HIOP組分及分子量大小的影響,結果見圖4,從圖4中可以看出，實驗組與未經酶解處理的HIOP相比,峰值的保留時間沒有發生改變。說明蛋白酶酶解處理對HIOP的分子量大小及組成并沒有產生影響,堿性蛋白酶處理可能只是對HIOP的生物活性中心結構產生了影響。

圖4 堿性蛋白酶酶解對HIOP物質的影響Fig.4 The effect of alkaline protease on composition of HIOP

2.3 胃蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性及組分的影響

由圖5可以看出,與未經酶解前的抑制率83.72%的 HIOP相比,胃蛋白酶酶解所得HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著降低。在蛋白酶酶濃度為500 U/mL時,α-葡萄糖苷酶抑制率僅為6.59%。酶濃度為1000 U/mL時,酶解處理后的HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率為6.30%。說明小劑量酶的添加顯著降低了HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率,而隨著酶添加量的增加,α-葡萄糖苷酶抑制率略微回升,可能是由于酶添加量的增加改變了α-葡萄糖苷酶酶解體系的環境,因此低劑量胃蛋白酶(500～1000 U/mL)的酶解結果更顯著代表酶解效果。

圖5 胃蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.5 Effect of pepsin hydrolysis on α-glucosidase inhibitory rate of HIOP

胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶,由胃部中的胃粘膜主細胞所分泌,功能是將食物中的蛋白質分解為小的肽片段,它作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵[27]。從圖5可以看出,蛋白酶酶解使HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著降低。推測可能是,蛋白酶水解了HIOP中結合蛋白里的芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵,從而使其α-葡萄糖苷酶抑制活性出現大幅度的下降,說明HIOP中的結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中有一定的作用,且結合蛋白中有芳香族氨基酸或酸性氨基酸。進一步研究胃蛋白酶酶解對HIOP組分及分子量大小的影響,結果如圖6所示,從圖6中可以看出,實驗組與未經酶解處理的HIOP相比,峰值的保留時間沒有發生改變。說明蛋白酶酶解處理對HIOP的分子量大小及組成并沒有產生影響,胃蛋白酶處理可能只是對HIOP的活性結構產生了影響。

圖6 胃蛋白酶酶解對HIOP物質的影響Fig.6 The effect of pepsin on composition of HIOP

圖7 胰蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.7 Effect of trypsin hydrolysis on α-glucosidase inhibitory rate of HIOP

2.4 胰蛋白酶酶解對HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性及組分的影響

由圖7可以看出,胰蛋白酶酶解處理后,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著降低。其中在胰蛋白酶酶濃度僅為500 U/mL時,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率降從未經酶解前的83.72%降至21.68%。并且,隨著酶活的增加,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率仍然不斷降低,并在1500 U/mL及以上時,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率變化不明顯。

胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶,能選擇性地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈,屬于是肽鏈內切酶[28]。如圖7所示,胰蛋白酶酶解處理后,HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著降低。推測可能是,胰蛋白酶水解了HIOP中結合蛋白里由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈,從而使其α-葡萄糖苷酶抑制活性出現大幅度的下降,說明HIOP中的結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中有一定的作用,且結合蛋白中有賴氨酸或精氨酸。進一步研究胰蛋白酶酶解對HIOP組分及分子量大小的影響,結果如圖8所示,從圖8中可以看出,實驗組與未經酶解處理的HIOP相比,峰值的保留時間沒有發生改變。說明蛋白酶酶解處理對HIOP的分子量大小及組成并沒有產生影響,胰蛋白酶處理可能只是對HIOP的活性結構產生了影響。

圖8 胰蛋白酶酶解對HIOP物質的影響Fig.8 The effect of trypsin on composition of HIOP

3 結論

HIOP中結合蛋白在HIOP的α-葡萄糖苷酶抑制活性中是有一定的作用。結合四種蛋白酶的作用效果與作用鍵型推測,HIOP中的結合蛋白可能含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸、賴氨酸或精氨酸,破壞此類肽鍵,α-葡萄糖苷酶抑制活性明顯降低。四種蛋白酶酶解均未使HIOP分子量發生較大改變,說明四種蛋白酶僅影響了HIOP與α-葡萄糖苷酶活性中心結合的部位。本文通過對多糖HIOP的結構的初步研究,為后期研究多糖分子的結構、結構修飾等提供了一定理論基礎。

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Effects of four kinds of proteases onα-glucosidase inhibitory activity of polysaccharide fromInonotusobliquus

TONG Shi-sheng1,HU Jin-rong2,ZHANG Jing-sheng2,DONG Wen-xia2,WANG Li2,LIU Ping2,*

(1.Bio-pharmaceutical College,Beijing City University,Beijing 100094,China; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The relationship betweenα-glucosidase inhibitory activity and the composition bond type of binding protein of high temperature water-extracted polysaccharides(HIOP)that extracted fromInonotusobliquuswas studied. HIOP was enzymatically digested with four different proteases,and the effect of protease hydrolysis on its molecular weight composition andα-glucosidase inhibitory activity was determined. The inhibitory rate ofα-glucosidase by original HIOP was 83.72% at 10 μg/mL,while the lowestα-glucosidase inhibition rate of HIOP that hydrolyzed by neutral protease,alkaline protease,pepsin,and trypsin were 53%,65%,6.5% and 7.1%,respectively. The binding protein in HIOP had a role in theα-glucosidase inhibitory activity of HIOP. In addition,in consideration of the effects of these four kinds of enzymes,it could be speculated that the active sites of the binding proteins in HIOP contain aromatic amino acids,acidic amino acids,lysine or arginine. If we destroy such peptide bonds,theα-glucosidase inhibitory activity of HIOP could be significantly reduced. But,the four proteases did not change the molecular weight of HIOP,indicating that the four proteases only affected the binding site of HIOP toα-glucosidase activity center.

the polysaccharide ofInonotusobliquus;proteases;α-glucosidase activity

2016-11-28

佟世生(1970-)，男，博士，研究方向：天然產物的開發與利用，E-mail：shishengt@163.com。

*通訊作者:劉萍(1970-)，女，博士，研究方向：多糖結構與功能，E-mail：liuping@cau.edu.cn。

國家自然基金項目(21576282)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)14-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.032