利用纖維素酶降解瓊脂糖的條件優化

李慶旺,熊 瑤,蔡坤淇,MIAO Song,3,張龍濤,*,鄭寶東(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，愛爾蘭科克市 999014)

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利用纖維素酶降解瓊脂糖的條件優化

李慶旺1,2,熊 瑤1,2,蔡坤淇1,2,MIAO Song1,2,3,張龍濤1,2,*,鄭寶東1,2
(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350002; 3.替格斯食品研究中心，愛爾蘭科克市 999014)

本文以還原糖生成量為指標,研究纖維素酶降解瓊脂糖的條件。在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken實驗設計和響應面分析對瓊脂糖酶解條件進行優化,確定4個因子(纖維素酶含量、酶解溫度、pH和酶解時間)的適宜水平,建立纖維素酶含量、酶解溫度、pH和酶解時間與酶解率之間的回歸模型,并對酶解產物進行初步鑒定。最優酶解條件:底物含量0.2%、纖維素酶含量1909.3 U/mL、酶解溫度50.0 ℃、pH4.9、酶解時間24.2 h,該條件下瓊脂糖的酶解率為29.58%±0.26%。薄層色譜(TLC)鑒定結果表明酶解主要產物為聚合度2～6的瓊膠低聚糖。

瓊脂糖,響應面法,酶解條件,薄層色譜

瓊脂糖又稱瓊膠糖或瓊膠素,是從瓊膠中提純出來的不含或少含硫酸酯(鹽)的非離子型多糖,是一種不帶電荷的中性基本結構[1-2],為瓊膠的主要組成成分,其基本結構是1,3連結的β-D-半乳糖和1,4連結的3,6-內醚-L-半乳糖交替連接起來的長鏈。瓊膠寡糖(AOS)是指瓊膠多糖經水解后聚合度(DP)為2～10的低聚糖,是由瓊二糖的重復單位連接而成[3]。由于具有較強的抗癌、抗氧化、抗炎、抗齲齒及抗淀粉老化等功能活性,在食品、醫藥、化妝品等方面可見較多的應用研究[4-7]。

目前,瓊膠低聚糖的主要制備方法為化學法[8-10]和酶法[11-13]。化學法制備瓊膠低聚糖存在條件難控制、產物不均一、分離純化過程繁瑣和回收難等問題。瓊膠低聚糖的酶法制備反應條件溫和,產物較為單一,近年來得到較多研究者的關注。瓊膠酶是目前用于專一性降解瓊脂糖的酶種[14-16],然而用微生物分泌生產制備的瓊膠酶制劑分離困難、產量有限,尚未能在瓊膠低聚糖的產業化制備中獲得應用[17-19]。本課題組在前期研究篩選獲得商業纖維素酶制劑,可降解瓊脂糖獲得瓊膠低聚糖,工藝簡單,成本低廉,具有一定的產業化前景。本文對纖維素酶降解瓊脂糖的酶解條件進行優化,并對酶解產物進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂糖(agarose) 美國amresco公司;纖維素酶 美國amresco公司,來源于里氏木霉Trichodermareesei,酶活力:≥400 U/mg;新瓊二糖標準品(NA2)、新瓊四糖標準品(NA4)、新瓊六糖標準品(NA6) 美國Sigma-Aldrich公司;高效硅膠層析板(G60 F25420 cm×20 cm) 德國Merck公司;其他化學試劑 均為分析純，國藥集團上海化學試劑有限公司。

T6系列紫外可見分光光度計 北京普析通用有限責任公司;DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司;Allegra X-30R型臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;PL202-S100型精密分析天平 上海Mettler Toledo儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;101-0型電熱鼓風干燥箱 上海陽光實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 瓊膠低聚糖的制備 稱取不同質量的瓊脂糖粉末,溶解到0.05 mol/L醋酸鹽緩沖溶液中,分別加入不同量的纖維素酶,在不同溫度下,酶解一定時間。反應結束后,調節pH至中性,沸水浴加熱10 min滅酶,10000×g離心15 min后取上清,DNS法測定還原糖含量。

1.2.2 瓊脂糖酶法水解單因素實驗 采用1.2.1方法酶解瓊脂糖,進行單因素實驗,考察不同因素對瓊脂糖酶解率的影響。酶解條件為:

固定反應條件為：纖維素酶含量2000 U/mL、酶解溫度50 ℃、pH5.0、酶解時間24 h,考察不同底物含量(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0%(w/v))對酶解率的影響;

固定反應條件為：底物含量0.2%、酶解溫度50 ℃、pH5.0和酶解時間24 h,考察不同纖維素酶含量(400、800、1200、1600、2000和2400 U/mL)對酶解率的影響;

固定反應條件為：底物含量0.2%、纖維素酶含量2000 U/mL、pH5.0和酶解時間24 h,考察不同酶解溫度(30、40、50、60和70 ℃)對酶解率的影響;

固定反應條件為：底物含量0.2%、纖維素酶含量2000 U/mL、酶解溫度50 ℃和酶解時間24 h,考察不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0和7.0)對酶解率的影響;

固定反應條件為底物含量0.2%、纖維素酶含量2000 U/mL、pH5.0和酶解溫度50 ℃,考察不同酶解時間(2、6、12、18、24和30 h)對酶解率的影響。

1.2.3 響應面法優化瓊脂糖酶法水解的影響因素 以瓊脂糖的酶解率作為響應值,在單因素實驗的基礎上,篩選出對瓊脂糖的酶解率影響顯著的因素進行因素水平設計,利用Design-Expert軟件進行Box-Behnken Design響應面設計[20-21],以確定最優酶解工藝,并進行驗證實驗。實驗因素水平設計和編碼見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.4 還原糖含量測定 參照文獻并作修改[22],準確稱取干燥至恒重的半乳糖100 mg,去離子水溶解后,定容至100 mL,即為1.0 mg/mL半乳糖溶液。取6支25 mL比色管,分別移取0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL半乳糖溶液到比色管中,并用去離子水補足至1 mL,至半乳糖溶液終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL,再分別加入2 mL DNS試劑,混合均勻,在沸水中加熱5 min,取出后立即用冷水冷卻到室溫,再向每管加入5 mL去離子水,至總體積為10 mL,混勻后,在540 nm處測定OD值。以等量去離子水代替半乳糖溶液為對照。以半乳糖含量作為橫坐標,吸光度作為縱坐標繪制標準曲線。對照半乳糖含量標準曲線,根據對照組和實驗組在OD540下吸光值的差值,計算酶解后產生的還原糖含量。

1.2.5 瓊脂糖酶解率的計算 酶解率(%)=酶解反應中還原糖的含量(mg/mL)/底物含量(mg/mL)×100。

1.2.6 酶解產物的TLC薄層色譜分析 參照文獻并作修改[23]。將薄層層析硅膠板于100 ℃活化1 h,冷卻,將上清液用毛細管點樣于薄層板上,然后放入展開室的展開劑(正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶1∶1)中,等溶劑上升至硅膠板頂端邊緣時,取出薄層板晾干。均勻地噴涂顯色劑(10%濃硫酸、0.2%間苯二酚溶于無水乙醇),用電吹風冷風緩慢吹干薄層板,置于105 ℃烘箱中,顯色10 min。以NA2、NA4和NA6作為標準對照。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 半乳糖標準曲線

由圖1可知,半乳糖標準曲線的方程為y=2.203x-0.1557,R2=0.9974。半乳糖質量濃度在0.1～0.5 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 D-半乳糖含量標準曲線Fig.1 The standard curve of concentration of D-galactose

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 底物含量對酶解率的影響 由圖2可知,隨著瓊脂糖含量的增加,瓊脂糖的酶解率逐漸降低,且瓊脂糖添加量過多時,會形成部分凝膠,影響酶解效率。因此選擇0.2%瓊脂糖含量,此時瓊脂糖酶解率為28.24%。

圖2 底物含量對酶解率的影響Fig.2 Effects of substrate content on enzymatic hydrolysis yield

2.2.2 纖維素酶含量對酶解率的影響 由圖3所知,在纖維素酶含量為400～2400 U/mL之間,隨著纖維素酶含量的增加,瓊脂糖的酶解率也隨之迅速增加,在纖維素酶含量為2000 U/mL時,酶解率達到最大,為28.21%。此后隨著纖維素酶含量的增加,酶解率反而下降,可能是由于此時還原糖的溶出已達到飽和,使酶解率稍有下降。考慮到經濟因素,初步選擇纖維素酶含量為2000 U/mL。

圖3 纖維素酶含量對酶解率的影響Fig.3 Effect of cellulase content on enzymatic hydrolysis yield

2.2.3 酶解溫度對瓊脂糖酶解率的影響 由圖4所知,在溫度為30～50 ℃之間,隨著溫度的升高,瓊脂糖的酶解率也隨之增加;在50 ℃之后,隨著溫度的逐漸升高,酶解率逐漸降低,可能是因為,溫度的升高,超出了纖維素酶耐受的溫度范圍,使酶逐漸失活,導致酶解率下降。因此,在溫度為50 ℃時,酶解率最高為28.02%。

圖4 酶解溫度對酶解率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis yield

2.2.4 pH對瓊脂糖酶解率的影響 由圖5所知,在pH3.0～5.0之間,隨著pH的升高,瓊脂糖的酶解率也隨之增加;在pH5.0之后,隨著pH的逐漸升高,酶解率逐漸降低,可能是因為,pH的升高,超出了纖維素酶最適的pH范圍,抑制了纖維素酶酶活,導致酶解率下降。因此,在pH5.0時,酶解率最高為28.42%。

圖5 pH對酶解產率的影響Fig.5 Effect of pH on enzymatic hydrolysis yield

2.2.5 酶解時間對瓊脂糖酶解率的影響 由圖6可知,在酶解時間為2～24 h之間,隨著酶解時間延長,瓊脂糖的酶解率也隨之迅速增加,在酶解時間為24 h時,酶解率達到最大為28.21%。此后隨著纖維素酶含量的增加,酶解率反而下降,考慮到酶解時間越長,對酶活會產生抑制作用,初步選擇酶解時間為24 h。

圖6 酶解時間對酶解率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis yield

表2 Box-Behnken實驗設計和結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 Box-Behnken的實驗方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

注:“*”表示差異顯著(p≤0.05);“**”表示差異極顯著(p≤0.01);“***”,表明差異高度顯著(p≤0.001)。

2.3 Box-Behnken實驗設計和結果分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken Design的響應曲面實驗設計原理,根據上述單因素實驗的結果,選取對瓊脂糖的酶解率有顯著影響的4個因素,進行響應面設計。以4個主要因素纖維素酶含量(A)、酶解溫度(B)、pH(C)和酶解時間(D)為自變量(X),以3次實驗所得的瓊脂糖酶解率為響應值(Y),每個因素設置3個水平,進行響應面優化實驗。根據響應面實驗結果,考察這4個顯著性因素之間存在的交互作用并確定酶解率最優時各因素取值。Box-Behnken的實驗設計和結果見表2。

根據Design-Expert 8.0.6軟件的響應面統計方法對表2的實驗數據進行擬合,得到瓊脂糖酶解率(Y)關于自變量(X)纖維素酶含量(A)、酶解溫度(B)、pH(C)和酶解時間(D)的二次多元回歸方程:

Y=29.31-0.62A+0.14B-0.16C-0.074D+0.17AB+0.18AC-0.21AD-0.048BC-0.26BD-0.34CD-0.73A2-0.47B2-0.53C2-0.76D2

回歸方程的方差分析見表3。

由表3可知,模型的F值為97.76,p<0.0001,模型擬合度較好;且失擬項影響不顯著(p=0.6786>0.05),表明該模型具有統計學意義,有很好的穩定性,回歸模型和實測值擬合度較好,能對瓊脂糖的酶解率進行分析及預測。該模型的復相關系數R2=0.9899,校正相關系數R2=0.9797,表明該模型可解釋97.97%的實驗結果。標準差系數(CV)為0.35%,說明模型能較好地反映各因素和酶解率之間的實測值,實驗具有很高的可靠性。

由回歸方程各變量的系數顯著性檢驗可得出,各自變量對瓊脂糖酶解率的影響依次為纖維素酶含量(A)>pH(C)>酶解溫度(B)>酶解時間(D),同時A、C和D與酶解率呈負相關關系,B與酶解率呈正相關關系。模型自變量的一次項A和C影響高度顯著(p<0.0001),B影響極顯著(p<0.01),D影響顯著(p<0.05);自變量的交互項AD、BD、CD影響高度顯著(p<0.0001),AB、AC影響極顯著(p<0.01),說明各因素間的交互作用顯著,BC影響不顯著(p>0.05),說明兩者之間無交互作用。二次項A2、B2、C2、D2的影響均為高度顯著。

2.4 響應面分析

為了觀察某兩個因素及其交互作用同時對酶解率的影響,保持其他因素條件不變,得到某兩個因素及其交互作用對酶解率影響的一元二次方程,從而得到響應曲面圖,確定因素的最佳水平范圍。分別固定自變量纖維素酶含量(A)、酶解溫度(B)、pH(C)和酶解時間(D)在原點,利用Design-Expert 8.0.6軟件,繪制出其他兩個變量的響應曲面圖,結果如圖7～圖12所示。

由圖7可知,響應曲面的坡度相對很陡峭,表明酶解率對纖維素酶含量和酶解溫度的改變比較敏感。當固定纖維素酶含量時,酶解率呈先緩慢增加后緩慢減小的趨勢;當固定酶解溫度時,酶解率呈先緩慢增加而后快速降低的趨勢。由圖8可知,響應曲面的坡度相對很陡峭,表明纖維素酶含量和pH之間有較強的交互作用。當固定纖維素酶含量時,酶解率呈先平穩增加后緩慢減小的趨勢;當固定pH時,酶解率呈先緩慢增加而后快速降低的趨勢。由圖9可知,響應曲面的坡度相對較為平緩,當固定某一因素時,酶解率均呈先緩慢增加后緩慢減小的趨勢。由圖10可知,曲面投影呈圓形,兩因子的交互不顯著。由圖11可知,響應曲面的坡度相對較為陡峭,表明酶解溫度和酶解時間之間有很好的交互作用。當酶解溫度不變時,酶解率呈先緩慢增加而后逐漸降低的趨勢;當酶解時間不變時,酶解率呈緩慢增加后趨于平穩的趨勢。由圖12可知,響應曲面的坡度相對較為陡峭,表明響應值(酶解率)對pH和酶解時間的改變較為敏感。當固定某一因素時,酶解率均呈先緩慢增加后緩慢減小的趨勢。

圖7 纖維素酶含量和酶解溫度對酶解率的影響Fig.7 Effect of cellulase content and enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis yield

圖8 纖維素酶含量和pH對酶解率的影響Fig.8 Effect of cellulase content and pH on enzymatic hydrolysis yield

圖9 纖維素酶含量和酶解時間對酶解率的影響Fig.9 Effect of cellulase content and enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis yield

圖10 酶解溫度和pH對酶解率的影響Fig.10 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH on enzymatic hydrolysis yield

圖11 酶解溫度和酶解時間對酶解率的影響Fig.11 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis yield

圖12 pH和酶解時間對酶解率的影響Fig.12 Effect of pH and enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis yield

2.5 回歸模型的驗證實驗

進一步通過軟件Design-Expert 8.0.6分析預測,酶解率達到最高時,纖維素酶含量為1909.3 U/mL、酶解溫度為50.0 ℃、pH為4.9和酶解時間為24.2 h,此時酶解率為29.47%。為了驗證模型的可靠程度,根據軟件預測的最佳酶解條件進行3次平行酶解實驗,實驗結果顯示瓊脂糖的酶解率為29.58%±0.26%,與預測值接近,表明真實值和預測值具有較高的擬合度,驗證了模型的可靠性。

2.6 酶解產物的TLC薄層色譜分析

TLC分析酶解產物的結果如圖13所示。與標準品對比,纖維素酶酶解主要產物為聚合度2～6的瓊膠低聚糖,以及少量聚合度6以上的瓊膠低聚糖。

圖13 酶解產物的TLC分析Fig.13 TLC analysis of agarose degradation

3 結論

通過單因素實驗和響應面實驗對瓊脂糖酶解條件的優化,確定了瓊脂糖酶解的適宜條件:底物含量0.2%、纖維素酶含量1909.3 U/mL、酶解溫度50.0 ℃、pH4.9和酶解時間為24.2 h。在上述條件下進行驗證實驗,得到的酶解率為29.58%±0.26%,主要產物為聚合度2～6的瓊膠低聚糖。

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Optimization of enzymolysis conditions for degradation of agarose by cellulase

LI Qing-wang1,2,XIONG Yao1,2,CAI Kun-qi1,2,MIAO Song1,2,3,ZHANG Long-tao1,2,*,ZHENG Bao-dong1,2

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.China-Ireland International Cooperation Laboratory of Foods Material Science and Structural Design,Fuzhou 350002,China; 3.Teagasc Food Research Centre,Moorepark,Fermoy,Co. Cork 999014,Ireland)

In this paper,the conditions of cellulose enzymatic degradation of agarose were studied with the yield of reducing sugar as the index. Following single factor experiment,the enzymatic hydrolysis conditions of agarose were optimized by four factors(cellulase content,enzymolysis temperature,pH and enzymolysis time)Box-Behnken experiment design and response surface methodology(RSM),and a regression model was established for predicting the enzymatic hydrolysis yield at different levels of cellulase content,enzymolysis temperature,pH and enzymatic hydrolysis time. In addition,the enzymatic hydrolysate products were preliminary identified. The optimum enzymolysis parameter,including,the substrate content was 0.2%,the cellulase content was 1909.3 U/mL,the enzymolysis temperature was 50.0 ℃,the pH was 4.9,and the enzymolysis time was 24.2 h. Under these conditions,the enzymolysis rate of agarose reached 29.58%±0.26%. The results of thin layer chromatography(TLC)showed that the main products were agar oligosaccharides with polymerization degree of 2～6.

agarose;response surface methodology;enzymatic hydrolysis conditions;thin layer chromatography(TLC)

2017-02-28

李慶旺(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：農產品加工技術，E-mail：1165326411@qq.com。

*通訊作者:張龍濤(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品材料與結構設計，E-mail：zlongtao@hotmail.com。

TS201.7

B

1002-0306(2017)14-0156-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.031