響應(yīng)面法優(yōu)化擬威爾嗜殺酵母Cyberlindneramrakii WM1代謝產(chǎn)嗜殺因子的發(fā)酵條件

譚春明,楊少玲,楊賢慶,于 剛,*(.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 50300; 2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

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響應(yīng)面法優(yōu)化擬威爾嗜殺酵母CyberlindneramrakiiWM1代謝產(chǎn)嗜殺因子的發(fā)酵條件

譚春明1,2,楊少玲1,楊賢慶1,于 剛1,*
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300; 2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

以保藏于本實驗室的海洋酵母菌種資源庫的酵母菌株CyberlindneramrakiiWM1為研究對象,以人類條件致病菌白色假絲酵母CanidiaalbicansYTS-03為嗜殺毒素抑菌活性測試指示菌,以抑菌圈直徑為考察指標,對擬威爾嗜殺酵母WM1代謝產(chǎn)嗜殺因子的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。首先以接種量、發(fā)酵液pH、發(fā)酵溫度和時間為自變量,確定其四個因素對嗜殺活性的抑菌效果影響顯著,再對這四個因素進行響應(yīng)面實驗優(yōu)化。獲得WM1生長代謝產(chǎn)嗜殺因子的最佳發(fā)酵條件為:接種量8%,發(fā)酵液pH4.0,發(fā)酵溫度21 ℃,發(fā)酵時間2.5 d。優(yōu)化后的WM1酵母發(fā)酵液的抑菌圈的直徑達到21.00 mm,比優(yōu)化前(16.5 mm)提高27.3%;菌液濃度也達2.58×108CFU/mL,比優(yōu)化前(1.9×108CFU/mL)提高了35.8%。同時,最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的實驗結(jié)果與模型預(yù)測值相吻合,說明建立的回歸模型是切實可行的。

響應(yīng)面,嗜殺酵母,嗜殺因子,發(fā)酵條件

嗜殺因子是嗜殺酵母在生長代謝過程中產(chǎn)生的,能夠抑制或殺死某些特定的微生物,而這種嗜殺因子對酵母本身卻沒有嗜殺作用。近年來,嗜殺酵母作為工業(yè)生產(chǎn)菌株而被廣泛使用,已被應(yīng)用于發(fā)酵、食品、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。嗜殺酵母在發(fā)酵生產(chǎn)中可以凈化發(fā)酵體系和環(huán)境,提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量,提高生物穩(wěn)定性;在食品工業(yè),可抑制野生酵母的污染[2];在養(yǎng)殖業(yè),一些海洋嗜殺酵母可以控制某些海洋酵母菌引起的海洋動物疾病[3];同時,嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可作為抑制某些病原酵母及類酵母的抗真菌藥制劑[4]。

實驗發(fā)現(xiàn),嗜殺酵母CyberlindneramrakiiWM1對白色假絲酵母具有較好的殺滅作用。白色假絲酵母菌為條件致病菌,正常情況與機體處于共生狀態(tài),不引起疾病,但因某些因素破壞而失衡時,便在局部大量生長繁殖,引起皮膚、黏膜甚至全身性的內(nèi)源性感染。目前的防治手段并不能達到安全、高效與便捷,如果能利用這種嗜殺因子作為抗真菌藥制劑來治療白色念珠菌引發(fā)的疾病,將會帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益,這種嗜殺作用值得進一步研究。本文以WM1酵母菌株為研究對象,通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件,獲得該菌代謝產(chǎn)生高活性嗜殺因子的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù),為該菌株后期研究及在工業(yè)上大量生產(chǎn)嗜殺毒素提供一定的實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜殺酵母菌株CyberlindneramrakiiWM1 來自于本實驗室保藏的海洋酵母菌種資源庫;人類條件致病菌CanidiaalbicansYTS-03 由山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院婦科提供,分離自陰道內(nèi)分泌物樣品;美藍 Sigma公司;實驗所用試劑 均為分析純;YPD培養(yǎng)基 按文獻進行配制[5]。

SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司;?，擰YC-211型搖床 上海知楚儀器有限公司;德國Eppendorf PCR儀(Mastercycler gradient) 上海恒久醫(yī)療器械有限公司;UV752型紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 用接種針挑取WM1酵母單菌落接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃,140 r/min,振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 發(fā)酵條件的確定及優(yōu)化

1.2.2.1 接種量 配好的產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)初始pH4.5,取50 mL于500 mL三角瓶中,滅菌后分別按2%、4%、6%、8%、10%和12%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入,置于28 ℃、140 r/min搖床發(fā)酵,培養(yǎng)2 d,測定酵母所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性。

1.2.2.2 發(fā)酵液pH 500 mL三角瓶按10%體積裝液,用0.05 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,滅菌后按8%的接種量接入,置于140 r/min搖床發(fā)酵,溫度28 ℃,培養(yǎng)2 d,測定酵母所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性。

1.2.2.3 培養(yǎng)溫度 配好的產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH4.5,取50 mL于500 mL三角瓶中,滅菌后按8%的接種量接入,置于溫度分別為16、20、24、28、32和36 ℃的搖床發(fā)酵,轉(zhuǎn)速為140 r/min,培養(yǎng)2 d,測定酵母所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性。

1.2.2.4 發(fā)酵時間 配好的產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH4.5,取50 mL于500 mL三角瓶中,滅菌后按8%的接種量接入,置于140 r/min搖床發(fā)酵,溫度24 ℃,分別培養(yǎng)12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和72 h,測定酵母所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性。

1.2.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇接種量(A)、發(fā)酵液pH(B)、培養(yǎng)溫度(C)及發(fā)酵時間(D)四個因素為自變量,利用Design-Expert(V 8.0.5)軟件,通過Box-Behnken模型進行中心組合實驗設(shè)計,以酵母所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗[6-9]。實驗結(jié)果取三次的平均值,實驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.3 菌液濃度的測定 采用比濁法,根據(jù)菌懸液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比,可以用分光光度計測600 nm波長處的OD值,用OD值作為待測菌株菌液濃度指標,其菌液濃度由標準曲線獲得[10]。取一標準樣液稀釋不同濃度,測定其OD值并采用平板計數(shù)法獲取相對應(yīng)濃度的細胞數(shù)量,以菌液濃度為橫坐標(X),不同濃度發(fā)酵液OD600 nm值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,標準曲線的方程為Y=0.6677X+0.0202,R2=0.9998。不同發(fā)酵水平的菌液濃度便可通過測定OD600 nm的形式由標準曲線得到。

1.2.4 嗜殺活性的測定 將病原酵母敏感菌株YTS-03接種于裝有50 mL YPD 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,取2.0 mL的菌體5000×g離心5 min,棄上清,用無菌水洗滌3次,最后用無菌水懸浮菌體,根據(jù)OD600與細胞數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系,將敏感菌株YTS-03 的細胞量調(diào)節(jié)至107～108cells/mL。使用前搖勻菌懸液,用滅菌的棉簽沾上并涂布于嗜殺活性檢測培養(yǎng)基平板上,靜置5 min左右,讓菌液完全被平板吸收,然后將滅好菌的牛津杯(Oxford-cups,6.0 mm×10.0 mm)放置于平板中央,取250.0 μL的待測樣品加入到牛津杯中。將平板移至28 ℃的烘箱中培養(yǎng)1～2 d,用尺子量取抑菌圈的直徑并記錄[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,采用Design-Expert(V 8.0.5)軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性和回歸分析,運用Office 2007軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量對酵母菌株發(fā)酵水平的影響 從圖1可知,微生物的生長和嗜殺因子產(chǎn)生表現(xiàn)的趨勢并不完全一致,隨著接種量的增加,酵母生長逐漸加強,而所產(chǎn)嗜殺因子的嗜殺活性開始增強并在接種量為8%時達到最高值,之后隨著接種量的增加嗜殺活性反而下降。從有利于產(chǎn)嗜殺因子來說,WM1的生長代謝需要適宜的接種量,過低和過高所產(chǎn)嗜殺因子活性都較低,不利于酵母的發(fā)酵應(yīng)用。這主要是因為接種量過低時在有限的發(fā)酵時間下菌液濃度較低,所產(chǎn)嗜殺因子量少;而接種量過高時,因培養(yǎng)基的營養(yǎng)有限,供菌株生長后沒有足夠的營養(yǎng)來產(chǎn)嗜殺因子,導(dǎo)致所產(chǎn)嗜殺因子量少。因此以后的實驗都在接種量為8%的條件下進行。

圖1 接種量對WM1生長狀況及嗜殺能力的影響Fig.1 Effect of inoculum concentration on growth status and killing ability of WM1

2.1.2 發(fā)酵液pH對酵母菌株發(fā)酵水平的影響 從圖2可知,WM1適宜偏酸環(huán)境生長,最適生長pH為5.0,發(fā)酵液嗜殺能力在pH4.5最大值接近20 mm。在相同pH條件下,微生物生長與嗜殺能力的趨勢表現(xiàn)出一定的一致性及差異性。隨著pH升高,微生物生長及嗜殺能力均是先加強,分別在pH達到5.0和4.5時達到最大值,之后兩者都開始減弱。然而,從有利于產(chǎn)生嗜殺因子角度考慮,WM1適宜的生長代謝環(huán)境為pH4.5下進行。適宜酸性環(huán)境也是酵母生長的共性[11-12],在偏酸性條件下,有利于嗜殺因子的產(chǎn)生,對酵母WM1的發(fā)酵應(yīng)用也是有利的。所以,選定適宜的發(fā)酵pH為4.5。

圖2 發(fā)酵液pH對WM1生長狀況及嗜殺能力的影響Fig.2 Effect of fermentation liquid pH on growth status and killing ability of WM1

2.2.3 溫度對酵母菌株發(fā)酵水平的影響 從圖3可以看出,嗜殺酵母WM1最適生長溫度為28 ℃,但發(fā)酵溫度在24 ℃時嗜殺能力最佳,此時發(fā)酵液菌圈直徑達20 mm,兼顧生物的生長及較好的嗜殺能力,后續(xù)實驗選擇24 ℃作為適宜發(fā)酵溫度。酵母WM1受溫度的影響較大,不同溫度下培養(yǎng),其生長和嗜殺能力都表現(xiàn)出由低到高再到低的變化趨勢,而且嗜殺能力隨溫度變化幅度表現(xiàn)得較為突出,從16～24 ℃嗜殺能力增強,從24～36 ℃又開始急速下降,這與蛋白對溫度敏感是相一致的。

圖3 發(fā)酵溫度對WM1生長狀況及嗜殺能力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on growth status and killing ability of WM1

2.1.4 發(fā)酵時間對酵母菌株發(fā)酵水平的影響 從圖4可知,隨著發(fā)酵時間的延長,WM1的生長及發(fā)酵液活性均不斷增加,當發(fā)酵到第2 d時，酵母菌株的生長開始減弱,進入衰亡期;而發(fā)酵液的嗜殺活性依然增加,并在發(fā)酵時間為66 h時嗜殺活性出現(xiàn)最高值;此后,隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長,發(fā)酵液活性保持了穩(wěn)定值。從有利于嗜殺因子的產(chǎn)生及結(jié)合實際情況,確定該WM1酵母最佳發(fā)酵時間可以選擇為3 d。

圖4 發(fā)酵時間對WM1生長狀況及嗜殺能力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on growth status and killing ability of WM1

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 模型的建立及分析 以接種量、發(fā)酵液pH、培養(yǎng)溫度及發(fā)酵時間為實驗四因素,抑菌圈直徑為評價指標,按照二次項回歸方程進行實驗。BBD的完整設(shè)計矩陣和變量對響應(yīng)變量的交互作用見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

由表2可知,應(yīng)用Design-Expert(V 8.0.5)軟件進行多元回歸擬合[13-14],可得接種量(A)、發(fā)酵液pH(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時間(D)與抑菌圈直徑(Y)的關(guān)系,如下公式所示:

Y=5.22917+6.37500A-7.16667B+1.51042C-0.75000D-0.37500AB-0.031250AC+0.50000AD+0.62500BC+3.00000BD+0.18750CD-0.33854A2-1.91667B2-0.10026C2-3.91667D2

對回歸方程進行方差分析,分析結(jié)果見表3,該回歸模型p值為0.0002<0.01,而失擬項的p值為0.0821>0.05,說明模型回歸極其顯著,失擬檢驗不顯著,該實驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好,而且未知因素對實驗結(jié)果的干擾很小,模型適合。此外,通過F檢驗可以看出,pH和發(fā)酵時間的一次項極其顯著、發(fā)酵溫度的一次項顯著,接種量不顯著;發(fā)酵液pH和發(fā)酵溫度的交互項顯著,接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的二次項對抑菌圈直徑的影響都是顯著的,其中接種量和發(fā)酵溫度的二次項均處于極其顯著;該實驗?zāi)Ｐ蛯κ葰⒁蜃拥氖葰⒒钚蕴峁┝撕芎玫膬?yōu)化分析與預(yù)測。

表3 Box-Behnken實驗結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of Box-Behnken experiment results

注:*:p<0.05,差異顯著;**:p<0.01,差異極顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析 由表3可知,交互項BC、A2、C2、D2對Y均有顯著影響(p<0.05),而A2、C2對Y有極顯著影響(p<0.01),其交互作用的曲面圖如圖5～圖10所示。它反映了接種量、pH、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度這四個因素交互作用對響應(yīng)值的影響。通過方程二次項的系數(shù)是負的和曲面圖拋物線的開口是向下的,可知有一個最大值點,并且B、C、D三個因素及BC、A2、C2、D2的交互作用對抑菌圈直徑的影響顯著。從圖5～圖10可知,抑菌圈直徑開始隨著各因素值的增加而增加并到達最高點,之后開始下降,均有先增大后減小的趨勢,這些圖再一次的反映了B、C、D三個因素是影響抑制區(qū)直徑的重要因素。

圖5 接種量和pH對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 The 3D surface map of inoculum concentration and pH value effect on killer toxin produced by yeast strains

圖6 接種量和發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 The 3D surface map of inoculum concentration and fermentation temperature effect on killer toxin produced by yeast strains

圖7 接種量和發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 The 3D surface map of inoculum concentration and fermentation time effect on killer toxin produced by yeast strains

圖7 接種量和發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 The 3D surface map of inoculum concentration and fermentation time effect on killer toxin produced by yeast strains

圖8 pH和發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.8 The 3D surface map of pH value and fermentation temperature effect on killer toxin produced by yeast strains

圖9 pH和發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.9 The 3D surface map of pH value and fermentation time effect on killer toxin produced by yeast strains

圖10 發(fā)酵溫度和時間對菌株產(chǎn)嗜殺毒素影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.10 The 3D surface map of fermentation timeand fermentation temperature effecton killer toxin produced by yeast strains

利用Design Expert軟件,進行分析計算,可得產(chǎn)嗜殺毒素的最佳培養(yǎng)條件為:接種量8%、pH4.0、發(fā)酵溫度21 ℃、培養(yǎng)時間2.5 d,在此條件下嗜殺毒素的抑菌圈直徑達21.48 mm，活菌數(shù)為2.58×108CFU/mL。

2.2.3 發(fā)酵優(yōu)化條件的驗證 采用最優(yōu)條件進行實驗,測得酵母發(fā)酵液抑菌圈直徑為21.00 mm,與模型預(yù)測結(jié)果21.48 mm接近,說明此模型預(yù)測結(jié)果能較好地反映實際情況,結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)條件下實驗值和預(yù)測值的對比Table 4 Comparison between experimental and predicted responses at the optimum condition

驗證值和預(yù)測值之間的誤差為2.23%<5%,是顯著的,說明該模型可被用于優(yōu)化,并且優(yōu)化是成功有效的。

3 結(jié)論

利用Box-Behnken模型對擬威爾酵母WM1產(chǎn)嗜殺因子的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以獲得嗜殺酵母所產(chǎn)嗜殺因子活性最高的發(fā)酵條件,方差分析表明模型擬合度良好。最優(yōu)的發(fā)酵條件為:接種量8%,發(fā)酵液pH4.0,發(fā)酵時間2.5 d,發(fā)酵溫度21 ℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)140 r/min。通過發(fā)酵條件優(yōu)化,嗜殺因子活性相比優(yōu)化前得到顯著提高,其發(fā)酵液的嗜殺能力達最大值21.00 mm,比優(yōu)化前的(16.5 mm)提高27.3%;活菌數(shù)也達2.58×108CFU/mL,比優(yōu)化前(1.9×108CFU/mL)提高了35.8%。可見,通過對接種量、發(fā)酵液pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的響應(yīng)面優(yōu)化是成功有效的,這為高效發(fā)酵獲取高活性的嗜殺因子提供了技術(shù)指導(dǎo),為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵及進一步的研究提供基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions for killer toxin production fromCyberlindneramrakiiWM1 by response surface methodology

TAN Chun-ming1,2,YANG Shao-ling1,YANG Xian-qing1,YU Gang1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China; 2. Ocean University of China,College of Food Science and Engineering,Qingdao 266003,China)

The fermentation conditions for killer toxin production fromCyberlindneramrakiiWM1 preserved in the laboratory of marine yeast resource pool were optimized. The diameter of inhibition zone(mm)was used as evaluation index and quantified againstCanidiaalbicansYTS-03. Firstly,chose inoculum concentration,pH value,fermentation temperature and time as independent variables,based on these single factor tests,response surface methodology with the four variables was employed to optimize the fermentation conditions for killer toxin production. The optimum fermentation conditions ofCyberlindneramrakiiWM1 production for the growth and metabolism of killer toxin were inoculation of 8%,pH of 4.0,fermentation temperature of 21 ℃,fermentation time of 2.5 days. Under these optimal conditions,the WM1 killer yeast fermentation broth reached its maximum capacity of 21.00 mm,than before optimization(16.5 mm)to improve 27.3%. The number of viable cells also reached 2.58×108CFU/mL,compared with the previous optimization(1.9×108CFU/mL)improved 35.8%. At the same time,the experimental results obtained under the optimal fermentation conditions were in agreement with the predicted values,indicated the established regression model was feasible.

response surface;killer yeast;killer toxin;fermentation conditions

2016-11-28

譚春明(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工與功能食品，E-mail：cmtan_ouc@163.com。

*通訊作者:于剛(1972-)，男，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工及高值化利用，E-mail：gyu0928@163.com。

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201501C13)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0126-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.025