苦蕎中D-手性肌醇的純化及其抗氧化活性研究

胡園園,易若琨,王仲明,聶旭元,騫 宇,趙 欣(重慶第二師范學院,功能性食品協同創新中心,重慶 400067)

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苦蕎中D-手性肌醇的純化及其抗氧化活性研究

胡園園,易若琨,王仲明,聶旭元,騫 宇,趙 欣*
(重慶第二師范學院,功能性食品協同創新中心,重慶 400067)

采用超聲浸提法提取苦蕎D-手性肌醇(DCI),通過高碘酸鈉氧化法測定DCI含量,利用活性炭柱分離純化苦蕎粗提物,高效液相色譜法(HPLC)分析粗提物和純化產物的組成及含量。以VC、BHT為對照,通過對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的體外抗氧化評價體系和總還原力的測定,評價對比苦蕎DCI粗提物和純化產物的抗氧化活性。結果表明,苦蕎粗提物中D-手性肌醇的含量僅為0.129%,經活性炭柱純化后,苦蕎中D-手性肌醇的含量可以達到27.26%;苦蕎DCI提取物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基均具有不同程度的清除作用,同時具有較好的還原性，且DCI純化產物的抗氧化活性要明顯強于DCI粗提物。

苦蕎,D-手性肌醇,活性炭,高效液相色譜法,抗氧化

研究表明自由基(free radical)是引起癌癥、衰老、心腦血管退變性等疾病的重要原因之一[1]。當機體處于衰老狀態時,體內會產生大量的自由基,而抗氧化劑可以有效地消除自由基,使機體達到氧化還原平衡[2]。D-手性肌醇(DCI)為肌醇的一種,具有光學活性體,屬于B族維生素中水溶性維生素[3],研究表明D-手性肌醇除了具有肌醇促進肝臟脂代謝的功能外,還具有胰島素增敏、保護肝損傷、降血脂和降血糖等多種生理功能[4]。此外,張澤生[5]發現D-手性肌醇和肌醇均能顯著或極顯著提高小鼠不同組織中超氧化物歧化酶、總超氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,同時降低丙二醛的含量,對衰老的小鼠表現出有效的抗氧化效果,但是目前對于D-手性肌醇體外抗氧化活性的研究未見報道。苦蕎作為中國一種傳統的藥食兩用植物資源,不僅含有豐富的生物類黃酮,也含有少量的D-手性肌醇單體[6]。目前關于苦蕎的研究,多數集中在對苦蕎黃酮類化合物的功能活性研究,而苦蕎中DCI的抗氧化活性鮮有報道。本研究從苦蕎籽粒中提取D-手性肌醇并進行純化,然后對其純化前后的體外抗氧化活性進行測定,以期為苦蕎D-手性肌醇的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎籽粒 寧強縣羌州糧食有限公司提供;鐵氰化鉀、FeSO4、三氯乙酸(TCA)、高碘酸鈉、醋酸鈉、氯化鐵 均為分析純;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、甲基吩嗪甲基硫酸鹽(PMS) 均購自天津市富晨化學試劑廠;色譜級乙腈 購自美國Honeywell公司;無水乙醇、水楊酸、抗壞血酸、丁化羥基甲苯(BHT)、H2O2、D-手性肌醇(純度為99%)、粒狀活性炭 均為分析純,購自天津市天天化學試劑廠;蒸餾水和超純水 為實驗室自制。

RE-52AA旋轉蒸發儀 上海科恒實驗發展有限公司;YXJ-2高速臺式離心機 常州恒隆儀器有限公司;752N-紫外可見分光光度計 上海精科;KQ-300DE超聲波清洗器 上海五相儀器儀表有限公司;BPG-9030AH高溫烘箱 上海和呈儀器制造有限公司;EZ-DRY真空冷凍干燥儀 杭州豐漠冷凍設備制造有限公司;大孔吸附樹脂柱(Φ 30 mm×310 mm) 天津市東麗區天天化學試劑廠;MILLI-Q超純水儀 MILLIPORE公司;HH-6B數顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;AL104分析電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;FZ102微型植物粉碎機 黃驊市中興有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎中DCI的提取 參照盧丞文[7]的研究,選取超聲波浸提法提取苦蕎中DCI。先取適量的苦蕎籽粒,用粉碎機粉碎后,粉末過60目篩,稱取50 g,與體積分數為50%的乙醇溶液按1∶1 (g/mL)的比例混合均勻,并于50 ℃恒溫水浴超聲(功率為175 W)振蕩提取2 h,重復提取三次,合并提取液,3000 r/min離心10 min,取上清液,于65 ℃恒溫旋轉蒸發得到DCI濃縮液,然后置于真空冷凍干燥儀中冷凍干燥(加熱溫度為50 ℃,干燥室壓力為80 Pa),得到苦蕎DCI粗提物粉末,備用。

1.2.2 高碘酸鈉氧化法測定DCI含量

1.2.2.1 D-手性肌醇的標準曲線制作 參照文獻[8],稱取適量的D-手性肌醇標品,配制成一系列不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L)的DCI標準水溶液,各取2.0 mL分別加入4.0 mL的醋酸鈉緩沖液(pH4.5)和1.2 mL的高碘酸鈉溶液(0.01 mmol/L)后,于260 nm處測其吸光度(a),避光,于65 ℃水浴保存2 h,冷卻后,再測定260 nm吸光度(b),計算吸光值的變化情況(a-b),并以吸光值變化為縱坐標,以標準液濃度為橫坐標制作標準曲線。

1.2.2.2 D-手性肌醇含量的測定 稱取適量的苦蕎DCI粗提物,用蒸餾水溶解并于50 mL容量瓶中定容。使用1.2.2.1中的方法測定吸光值的變化,根據標準曲線計算DCI含量。

1.2.3 活性炭柱層析法分離純化D-手性肌醇 參照胡俊君的研究[9],采用30 mm×310 mm的色譜柱,稱取一定量的活性炭顆粒,采用濕法裝柱,將活性炭顆粒浸入過量的洗脫液中,攪拌均勻后,傾入色譜柱中。活性炭顆粒沉淀穩定后,稱取1 g DCI粗提物,加入60 mL體積分數50%的乙醇溶液溶解,并將上樣液的pH調至6～8,用體積分數為4%的乙醇溶液(pH3～4)進行洗脫,流速為0.2 mL/min,用帶刻度的試管收集洗脫液,每管收集6 mL,收集液隔管用高碘酸鈉氧化法跟蹤檢測,并于260 nm下測定吸光度,直至洗脫完全,然后合并洗脫液,減壓蒸餾,真空冷凍干燥(溫度50 ℃,壓力80 Pa)后得到純化后的苦蕎DCI提取物粉末,即DCI純化產物。

1.2.4 HPLC分析苦蕎DCI提取物的組成 參照本課題組已經建立的高效液相色譜分析方法[4]。用70%的乙腈水溶液溶解DCI標準品和樣品,使其濃度分別為0.18 mg/mL和1.8 mg/mL,然后用0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液備用。采用島津公司HPLC儀,示差折光檢測器,酰胺柱(4.6 mm i.d.×150 mm,5 μm)測定,洗脫液為體積分數為81%的乙腈溶液,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為512 nm,進樣量為20 μL。

1.2.5 D-手性肌醇體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[10]并稍作修改,評價對比純化前后的苦蕎DCI提取物對DPPH自由基的清除能力。將3.0 mL DPPH(1 mmol)溶液與1.0 mL不同濃度的樣品溶液分別加入試管中,充分混合,黑暗處理30 min,517 nm處測定吸光值。抗壞血酸作陽性對照,用蒸餾水做陰性對照,用甲醇代替DPPH做本底組對照。清除率按以下方法計算:

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa為樣品吸光值,Ab為樣品本底吸光值,A0為陰性對照值。

1.2.5.2 羥基自由基的清除能力測定 采用Fenton體系法[11]評價對比純化前后的DCI提取物對羥基自由基的清除能力。向10 mL離心管中依次加入1.0 mL樣品溶液,1.0 mL FeSO4溶液,1.0 mL水楊酸-乙醇溶液和1.0 mL H2O2溶液,37 ℃條件下水浴1 h,然后于510 nm處測定其吸光值。用蒸餾水做陰性對照和樣品本底對照。清除率的計算:

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa為樣品吸光值,Ab為樣品本底吸光值,A0為空白對照液的吸光度。

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa為樣品吸光值,Ab為樣品本底吸光值,A0為陰性對照值。

1.2.5.4 總還原能力測定 參考文獻[13]并修改,對DCI粗提物及DCI純化產物的總還原能力做對比和評價。取各濃度的樣品溶液1.0 mL,依次加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5 mL的1% K3[Fe(CN)6],50 ℃條件下水浴20 min后,再加入10% W/V的TCA(2.5 mL),混勻,并在3000 r/min下離心10 min,取2.0 mL的上清液于試管中,依次加入去離子水(2.0 mL)和0.1%的氯化鐵(0.5 mL),混勻,靜置10 min后,于700 nm處測定其吸光度值。用蒸餾水代替0.1%氯化鐵溶液做本底對照。

1.3 數據分析

所有實驗均重復三次,并采用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 D-手性肌醇標準曲線的測定

以標準DCI濃度為橫坐標,其對應吸光值為縱坐標,繪得DCI標準曲線,建立回歸方程。得到其標準曲線如圖1 所示。

圖1 DCI含量標準曲線圖Fig.1 The standard curve of D-chiro-inositol content

2.2 苦蕎粗提物的純化

按照上述1.2.3的方法,采用活性炭柱層析分離苦蕎粗提物中DCI。胡俊君已報道用體積分數為4%的乙醇洗脫液對DCI進行洗脫效果最佳[9],因此本研究選用體積分數為4%的乙醇溶液作為洗脫液進行DCI的洗脫。結果如圖2所示,活性炭柱層析分離純化得到了DCI的主要洗脫峰,表明洗脫液的成分較純,組分相對單一。收集所有洗脫液,真空冷凍干燥后得到純度較高的苦蕎DCI純化產物粉末。

圖2 DCI純化產物的活性炭柱層析圖Fig.2 Eluting curve of DCI on activated carbon column

由圖1和表1可知,當苦蕎粗提物和純化產物樣品的濃度均為0.05 mg/mL時,其吸光度值分別為0.021和2.75,代入DCI標準曲線中可求得樣品中DCI的濃度,經計算得粗提物中DCI的含量為0.129%(w/w);而經過活性炭柱純化后,純化產物中DCI的含量可以達到27.26%(w/w),結果表明通過活性炭柱可以較好的純化苦蕎中的DCI。

表1 苦蕎DCI的吸光值和純度Table 1 Absorption values and purity of DCI extract from tartary buckwheat

2.3 HPLC分析苦蕎D-手性肌醇提取物的組成

從標準品的高效液相色譜圖(圖3a)中可以清晰地看出,DCI在此實驗條件下可以較好地被分離,色譜峰出峰時間為3.93 min。由標準品(5～25 μL)的5個不同進樣量HPLC分析,獲得峰面積。以標準品的峰面積(y)為縱坐標,以各DCI物質的量(μmol,x)為橫坐標,繪制標準曲線,得到y=1.1×107x+1.9×105(R2=0.998,n=5)。將粗提物和純化產物分別得到的2個峰面積代入回歸曲線中,得出各樣品中DCI物質的量,并可計算出各樣品中DCI的含量,結果顯示與高碘酸鈉氧化法測定DCI含量的結果一致。從粗提物樣品的高效液相色譜圖(圖3b)中看出,樣品中含有較多的雜質,且檢測峰沒有完全被分離,而純化產物的高效液相色譜圖(圖3c)結果顯示雜質相對減少,色譜峰較清晰地被分離,且出峰面積顯著增大。結果表明經過活性炭純化后,部分雜質被去除,DCI的含量顯著增加。

圖3 標準品(a)、粗提物樣品(b)與純化產物樣品(c)高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of standards(a)、 crude extracts(b)and purification products(c)

2.4 DCI粗提物與DCI純化產物的體外抗氧化活性對比

2.4.1 對DPPH自由基的清除功效 DPPH溶液在紫外-可見光區具有較強的吸收光譜,加入抗氧化劑后,自由基被清除,使吸收光譜強度減小,且與加入的抗氧化劑的量呈反比,因此可以通過吸光度的變化計算DPPH自由基清除率[14]。按1.2.5.1方法,以一定濃度的VC、BHT、DCI粗提物和DCI純化產物為橫坐標,以吸光度值計算DPPH·的清除率，為縱坐標,結果見圖4。由圖4可知,DCI純化產物對DPPH自由基的清除能力遠小于VC,但稍大于DCI粗提物。當濃度為1 mg·mL-1時,VC的清除率可達到98.66%,DCI純化產物的清除率為58.55%,DCI粗提物的清除率為48.3%,BHT的清除率僅為42.3%,結果表明經活性炭柱純化后,DCI提取物清除DPPH自由基的能力稍有上升。在0.1～1 mg·mL-1范圍內,隨著樣品濃度的上升,樣品對DPPH自由基的清除能力均逐漸增強,表明苦蕎DCI提取物具有一定的抗氧化活性。

圖4 DCI粗提物與純化產物對DPPH·的清除能力的比較Fig.4 Comparison between D-chiro-inositol and purified product to the scavenging capacity of DPPH·

2.4.2 對羥基自由基的清除功效 水楊酸能與Fenton反應[15]中生成的·OH作用并產生有色物質。在該體系中加入具有清除·OH能力的物質,可以減少有色物質的生成。故可以通過測定吸光值的變化來判定該物質的清除·OH的能力,從而分析其抗氧化能力。分別以VC、BHT、DCI粗提物和DCI純化產物的濃度為橫坐標,所得吸光度值計算·OH的清除率,為縱坐標,結果見圖5。由圖5可知,DCI純化產物對羥基自由基的清除能力大于DCI粗提物,但弱于VC,BHT清除羥基自由基的能力最弱;且在0.1～1 mg·mL-1范圍內,隨著濃度的上升,VC、BHT和DCI提取物對羥基自由基的清除能力均逐漸增強,且DCI純化產物的清除能力增加速度最快,結果表明隨著DCI含量的增加,其抗氧化活性也逐漸增加。當DCI純化產物濃度為1 mg·mL-1時,其清除率達到89.49%,與VC的清除率(99.87%)接近。結果顯示,DCI提取物對羥自由基有一定的清除能力。

圖5 DCI粗提物與純化產物清除羥基自由基能力的比較Fig.5 Comparison between D-chiro-inositol and its purified product to the scavenging capacity of hydroxyl radical

圖6 DCI粗提物與純化產物清除超氧陰離子能力的比較Fig.6 Comparison between D-chiro-inositol and purified product to the scavenging capacity of superoxide anion

2.4.4 總還原能力的測定 樣品的還原力和抗氧化活性有明顯相關性,還原力測定依據樣品能夠提供電子的數目和難易程度,已知抗氧化劑是通過還原自身來清除自由基,物質的還原能力越大,其抗氧化性就越強。因此物質抗氧化活性的大小可以通過測定其還原力的大小來判斷[17]。分別以VC、BHT、DCI粗提物和DCI純化產物的濃度為橫坐標,以吸光度值為縱坐標,計算總還原力。由圖7知,在0.1～2.0 mg/mL濃度范圍內,DCI純化產物和粗提物的還原能力均隨著濃度的增加而增強,表明苦蕎DCI提取物具有一定的還原力,其中DCI純化產物的還原能力強于DCI粗提物和BHT,但低于VC,且隨著濃度的升高,DCI純化產物與粗提物的還原力差距逐漸增大。當DCI純化產物濃度為2.0 mg/mL時,其吸光度為0.486,而DCI粗提物的吸光值僅為0.314,而VC可以達到0.729,BHT的還原力最弱,其吸光值只有0.258。

圖7 DCI粗提物與純化產物的總還原能力比較Fig.7 Comparison between the D-chiro-inositol and its purified product to total reducing power

3 結論

采用超聲波浸提法從苦蕎中提取D-手性肌醇,并利用活性炭柱分離純化,得到純度較高的DCI提取物,測得苦蕎DCI純化產物中D-手性肌醇的含量為27.26%,是粗提物中DCI含量的211.3倍。高效液相色譜分析結果顯示經過活性炭柱純化后,苦蕎DCI提取物中雜質明顯減少,色譜峰分離效果較好。體外抗氧化研究結果表明,DCI純化產物對DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基的清除效果均比DCI粗提物的清除效果好,且具有更好的還原能力。本研究結果表明,DCI提取物具有較好的體外抗氧化活性,其抗氧化能力隨著濃度的增大而增強,且DCI純化產物抗氧化能力大于粗提物,遠大于BHT,但低于VC,可以作為一種有效的天然抗氧化劑。本研究結果為深入探究D-手性肌醇抗氧化機制及開發DCI抗氧化保健品及膳食補充劑奠定了一定的理論基礎。

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Study on purification and antioxidant activity of D-chiro-inositol from tartary buckwheat

HU Yuan-yuan,YI Ruo-kun,WANG Zhong-ming,NIE Xu-yuan,QIAN Yu,ZHAO Xin*

(Chongqing University of Education,Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing 400067,China)

The D-chiro-inositol was obtained by ultrasonic extraction from tartary buckwheat. The total D-chiro-inositol content was measured by sodium periodate oxidation method. The D-chiro-inositol was purified by activated carbon column. The composition of D-chiro-inositol extractions were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC)method. Moreover,the reducing power of D-chiro-inositol extractions on DPPH,hydroxyl radicals and superoxide anion free radicalinvitrowas measured. Results showed that the content of crude D-chiro-inositol extractions in tartary buckwheat only attained 0.129%,however,the content of purified buckwheat D-chiro-inositol by actived carbon column could be achieved 27.26%. The antioxidant ability of D-chiro-inositol extractions had higher DPPH free radical,superoxide anion free radical and hydroxyl free radical scavenging effects as well as good reducing capacity. Besides,the antioxidant ability of purified product was better than crude extracting from tartary buckwheat.

tartary buckwheat;D-chiro-inositol;activated carbon;HPLC;antioxidant activity

2016-11-28

胡園園(1990-)，女，碩士研究生，助教，主要從事食品加工和植物中天然產物提取分離與功能方面的研究，E-mail:790117529@qq.com。

*通訊作者:趙欣(1981-)，男，博士，教授，主要從事食品生物技術、食品分子營養與功能性食品方面的研究， E-mail:zhaoxin@cque.edu.cn。

重慶市教委科技項目(KJ1714357)；重慶高校創新團隊建設計劃資助項目(CXTDX201601040)；重慶市工程技術研究中心建設項目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)。

TS210.1

A

1002-0306(2017)14-0082-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.016