系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1表達(dá)的臨床意義

楊 舟 詹 鋒 林書典 符克英

(海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,海南 海口 570000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1表達(dá)的臨床意義

楊 舟 詹 鋒 林書典 符克英

(海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,海南 海口 570000)

目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達(dá)的臨床意義。方法 SLE患者88例，其中活動(dòng)期者35例(活動(dòng)組)，穩(wěn)定期25例(穩(wěn)定組)，腎病期28例(腎病組)，另選同期在醫(yī)院實(shí)施健康體檢的志愿者30例為對(duì)照組，檢測(cè)并對(duì)比各組CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平，各組SLE病情活動(dòng)度積分(SLEDAI)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)及補(bǔ)體C3水平，分析指標(biāo)間的相關(guān)性。結(jié)果 腎病組及活動(dòng)組CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平均明顯低于穩(wěn)定組和對(duì)照組，且腎病組明顯低于活動(dòng)組(均P<0.05)。腎病組及活動(dòng)組SLEDAI積分及ESR水平明顯高于穩(wěn)定組和對(duì)照組，補(bǔ)體C3水平明顯低于穩(wěn)定組和對(duì)照組，且腎病組SLEDAI積分及ESR水平明顯高于活動(dòng)組，補(bǔ)體C3水平明顯低于活動(dòng)組(均P<0.05)。根據(jù)Spearman相關(guān)性分析，患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1與SLEDAI積分和ESR均呈負(fù)相關(guān)，與補(bǔ)體C3呈正相關(guān)。結(jié)論 SLE患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平可隨疾病的進(jìn)展而下調(diào)表達(dá)，且可以預(yù)測(cè)患者病情進(jìn)展。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)屬于自身免疫性炎癥類型的結(jié)締組織疾病，高發(fā)于中青年女性人群，可累及身體多個(gè)臟器。該病的發(fā)病原因目前尚不明確，報(bào)道指出內(nèi)分泌以及免疫異常等在發(fā)病過程中十分重要，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)出現(xiàn)數(shù)量缺失以及功能缺陷等可作為SLE發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性因素。研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，CD4+CD25+Treg在確保機(jī)體免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，如其本身免疫耐受遭到破壞，則會(huì)致使機(jī)體出現(xiàn)免疫性疾病。而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1作為CD4+CD25+Treg的一種細(xì)胞因子，同樣具有高免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)病產(chǎn)生重要影響。有報(bào)道指出〔2〕，CD4+CD25+Treg及TGF-β1可能同SLE的發(fā)病存在一定關(guān)系。本文擬分析SLE患者CD4+CD25+Treg及TGF-β1表達(dá)的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選擇從2014年1月至2016年6月在醫(yī)院診治的SLE患者88例。其中男16例，女72例，年齡42～74〔平均(53.67±12.14)〕歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均已符合1982年時(shí)美國的風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3，4〕；(2)年齡>40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他種類的免疫性疾病；(2)存在原發(fā)性腎疾病；(3)血液類疾病；(4)惡性腫瘤。88例患者中，處于疾病活動(dòng)期者35例(活動(dòng)組)，男6例，女29例；年齡42～72〔平均(53.55±11.29)〕歲。穩(wěn)定期25例(穩(wěn)定組)，男4例，女21例；年齡43～71〔平均(54.01±10.68)〕歲。腎病期28例(腎病組)，男6例，女22例；年齡45～74〔平均(53.60±11.33)〕歲。其中腎病組以符合下列條件的任意1項(xiàng)以上進(jìn)行評(píng)定。(1)蛋白尿>0.5 g/24 h；(2)管型(表現(xiàn)為紅細(xì)胞或血紅蛋白，即顆粒管型，亦或是混合管型)；(3)經(jīng)腎活檢明確為狼瘡腎炎，且病理變化根據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定為≥Ⅱ型。另選同期在醫(yī)院實(shí)施健康體檢的志愿者30例作為對(duì)照組，男5例，女25例，年齡42～75〔平均(53.62±12.03)〕歲。各組年齡及性別等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得患者的簽字知情，且醫(yī)院的倫理委員會(huì)也已審批通過。

1.2 研究方法 對(duì)各組受試者分別抽取其晨間的空腹外周靜脈血約4 ml裝入2支試管各2 ml，其中1支為肝素抗凝管為管①，另1支分離血清為管②，3 000 r/min離心15 min后提取血清，置于-20℃的冰箱內(nèi)保存待測(cè)。利用美國貝克曼公司生產(chǎn)的FACS Calibur 流式細(xì)胞儀及2支儀器專用試管分別添加100 μl的全血標(biāo)本，為管①加入IgG1-PE及IgG1-FITC各20 μl，為管②加入CD4-PE及CD25-FITC 各20 μl，經(jīng)振蕩器混勻后，在室溫下進(jìn)行15 min的避光反應(yīng)，再添加1 ml的溶血素，于室溫下避光約20 min。而后添加2 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)，3 000 r/min離心15 min之后棄去上清液，添加500 μl 1%的多聚甲醛使細(xì)胞重懸。之后上機(jī)測(cè)定CD4+CD25+Treg比率。檢測(cè)時(shí)需根據(jù)前向散射及側(cè)向角散射的光信號(hào)為淋巴細(xì)胞群作好設(shè)門操作，在每份標(biāo)本中獲取設(shè)門中的10 000個(gè)細(xì)胞，將檢測(cè)數(shù)據(jù)通過listmode文件保存。利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血清TGF-β1水平。再常規(guī)檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率(ESR)及補(bǔ)體C3等疾病活動(dòng)性相關(guān)指標(biāo)。上述試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司，操作過程中應(yīng)嚴(yán)格遵守說明書的步驟進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比各組CD4+CD25+Treg及TGF-β1，各組SLE病情活動(dòng)度積分(SLEDAI)、ESR及補(bǔ)體C3水平，分析指標(biāo)間的相關(guān)性。其中SLEDAI積分表共24項(xiàng)〔5〕，得分0～4分表明SLE疾病無活動(dòng)；5～9分表明SLE疾病有輕度活動(dòng)；10～14分表明SLE疾病有中度活動(dòng)；≥15分表明SLE疾病有重度活動(dòng)。分值越高提示SLE患者的疾病癥狀越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)、方差分析和Spearman法。

2 結(jié) 果

2.1 各組CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平比較 腎病組及活動(dòng)組CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平均明顯低于穩(wěn)定組和對(duì)照組，且腎病組均明顯低于活動(dòng)組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組CD4+CD25+ Treg及TGF-β1水平比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與穩(wěn)定組比較:2)P<0.05；與活動(dòng)組比較:3)P<0.05；下表同

2.2 各組SLEDAI積分、ESR及補(bǔ)體C3水平比較 腎病組及活動(dòng)組SLEDAI積分及ESR水平明顯高于穩(wěn)定組和對(duì)照組，補(bǔ)體C3水平明顯低于穩(wěn)定組和對(duì)照組，且腎病組的SLEDAI積分及ESR水平明顯高于活動(dòng)組，補(bǔ)體C3水平明顯低于活動(dòng)組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組SLEDAI積分、ESR及補(bǔ)體C3水平比較

2.3 相關(guān)性分析 CD4+CD25+Treg及TGF-β1與SLEDAI積分和ESR均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.671，-0.693；-0.724，-0.680；均P<0.05)，與補(bǔ)體C3呈正相關(guān)(r=0.704，0.712；均P<0.05)。

3 討 論

SLE會(huì)導(dǎo)致患者皮膚出現(xiàn)特異性皮損，并引起骨骼以及肌肉疼痛，同時(shí)還會(huì)累及呼吸系統(tǒng)以及腎臟等系統(tǒng)。初步研究其發(fā)病機(jī)制發(fā)現(xiàn)〔6〕，患者在遺傳及環(huán)境等因素的共同作用下，發(fā)生T淋巴細(xì)胞水平下降以及T抑制細(xì)胞自身功能水平的下降等現(xiàn)象，并釋放出大量自身性抗體，同機(jī)體相關(guān)抗原相結(jié)合，進(jìn)而生成免疫復(fù)合物，在患者皮膚、關(guān)節(jié)及腎小球等位置沉積。目前研究認(rèn)為〔7〕，SLE疾病的發(fā)生主要和T細(xì)胞所介導(dǎo)的自身性免疫反應(yīng)直接相關(guān)，且其中CD4+CD25+Treg占主導(dǎo)地位。同時(shí)，TGF-β1作為CD4+CD25+Treg的一項(xiàng)重要轉(zhuǎn)化類細(xì)胞因子，具有控制維護(hù)機(jī)體免疫平衡以及改善免疫耐受等功能，其表達(dá)與SLE發(fā)病及病情發(fā)展之間的關(guān)系同樣已受到臨床高度關(guān)注。

本研究符合Tselios等〔8〕的報(bào)道結(jié)果，提示SLE患者的病情進(jìn)展與CD4+CD25+Treg及TGF-β1水平聯(lián)系緊密。可能是因?yàn)镃D4+CD25+Treg及TGF-β1的變化主要受到患者機(jī)體的免疫異常影響，而SLE疾病作為一類免疫系統(tǒng)性疾病，其進(jìn)展更易影響上述指標(biāo)的變化。詹淑霞等〔9〕報(bào)道，Treg對(duì)機(jī)體反應(yīng)性T細(xì)胞的自身生成和活化以及增殖等活動(dòng)均可發(fā)揮較好的調(diào)控作用。同時(shí)，其還可幫助維護(hù)機(jī)體免疫功能的正常狀態(tài)，確保外周免疫功能的正常。其中CD4+CD25+Treg可對(duì)機(jī)體受損之后所發(fā)生的免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，如機(jī)體出現(xiàn)CD4+CD25+Treg水平下降的情況，則會(huì)直接導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)自身性免疫類疾病，而目前已證實(shí)SLE屬于此類疾病，患者的確存在Treg數(shù)量缺失以及功能缺陷等情況〔10〕。TGF-β1在機(jī)體中的生成來源很廣，其可由各類淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞進(jìn)行合成及分泌而成，但是Treg在所有淋巴細(xì)胞中所占的比例不足5%，且對(duì)于SLE患者而言其所具有的Treg水平更低。具體而言，SLE患者體內(nèi)TGF-β1水平下降導(dǎo)致Treg生成水平大幅度下降，進(jìn)而降低患者的免疫耐受力，最終造成SLE的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，本研究結(jié)果還符合張曉莉等〔11〕的報(bào)道，提示隨著SLE患者疾病的進(jìn)展程度加劇，其SLEDAI積分及ESR、補(bǔ)體C3水平均出現(xiàn)了明顯異常。主要是因?yàn)镾LEDAI積分自身即是衡量SLE病情活動(dòng)度的一個(gè)評(píng)分量表，而ESR及補(bǔ)體C3可對(duì)SLE患者的病情作出生化指標(biāo)的直觀性呈現(xiàn)，因此SLEDAI積分及ESR、補(bǔ)體C3在SLE患者疾病進(jìn)展的情況下，分別表現(xiàn)出了相應(yīng)的變化。本文Spearman分析再次證實(shí)了SLE患者病情的進(jìn)展與上述指標(biāo)之間均存在較大關(guān)聯(lián)。其原因可能由于CD4+CD25+Treg數(shù)量下降，造成機(jī)體內(nèi)自身反應(yīng)型淋巴細(xì)胞受抑制的作用降低，影響了免疫功能，致使TGF-β1水平受到影響，進(jìn)而推進(jìn)SLE的發(fā)展進(jìn)程，并反過來影響患者的SLEDAI積分、ESR及補(bǔ)體C3水平〔12〕。

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8 Tselios K，Sarantopoulos A，Gkougkourelas I，etal.Increase of peripheral T regulatory cells during remission induction with cyclophosphamide in active systemic lupus erythematosus〔J〕.Int J Rheum Dis，2014；17(7)：790-5.

9 詹淑霞，陳 路，陸東慶，等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1與系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情活動(dòng)性關(guān)系的研究〔J〕.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012；11(4)：250-1，253.

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11 張曉莉，徐勝前，蔡 靜，等.補(bǔ)體C3水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)強(qiáng)度的關(guān)系研究〔J〕.中華全科醫(yī)師雜志，2016；15(5)：375-8.

12 Tselios K，Sarantopoulos A，Gkougkourelas I，etal.The influence of therapy on CD4+CD25(high)FOXP3+ regulatory T cells in systemic lupus erythematosus patients：a prospective study〔J〕.Scand J Rheumatol，2015；44(1)：29-35.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

詹 鋒(1962-)，男，主任醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病及腎臟病研究。

楊 舟(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病研究。

R593.24

A

1005-9202(2017)13-3305-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.085