褪黑素對軟脂酸誘導L02細胞胰島素抵抗的防護作用及機制

萬學東 王 博 陳群力 李三強 席守民

(河南科技大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 洛陽 471003)

褪黑素對軟脂酸誘導L02細胞胰島素抵抗的防護作用及機制

萬學東 王 博1陳群力 李三強 席守民

(河南科技大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 洛陽 471003)

目的 探討褪黑素(MT)對軟脂酸(PA)誘導L02細胞胰島素抵抗的防護作用及機制。方法 培養L02細胞，分別設立對照組(BSA組)、PA組、PA+MT組、PA+維生素C(VitC)組。各組藥物濃度和孵育時間根據不同的實驗需要來確定。用熒光比色法測定各組細胞胞內氧自由基(ROS)水平，Western印跡法檢測胰島素刺激后胞內胰島素信號蛋白磷酸化水平，包括Y-p-胰島素受體(IR)、Y-p-胰島素受體底物(IRS)1/2以及應激敏感激酶p-JNK水平。結果 用不同濃度的PA處理L02細胞24 h，細胞內ROS生成量呈現明顯的濃度依賴關系，差異有統計學意義(P<0.05)；用0.3 mmol/L的PA處理L02細胞不同時間，細胞內ROS生成量存在明顯的時間依賴關系，在24 h達到最高，并在36 h后仍維持較高水平(P<0.05)；與BSA組相比，PA組ROS含量明顯升高(P<0.05)PA+MT組ROS含量無明顯變化(P>0.05)；PA+MT組ROS生成量明顯低于PA組(P<0.05)。PA+VitC組與PA組相比，ROS的生成量減少，但仍高于PA+MT組(P<0.05)。與BSA組相比，PA組Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平減少，而p-JNK磷酸化水平升高；與PA組相比，PA+MT組Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平顯著升高，p-JNK磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。結論 PA導致細胞內ROS增加，MT能夠清除PA產生的過量ROS。MT通過減少JNK的活化，改善因ROS引起的胰島素信號傳遞損傷，對PA誘導的胰島素抵抗具有防護作用。

胰島素抵抗；活性氧ROS；褪黑素；胰島素受體；胰島素受體底物1/2；c-Jun 氨基末端激酶JNK

胰島素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的基本病理生理現象之一，并貫穿其發生發展的始終。血清游離脂肪酸(FFA)水平升高，在胰島素抵抗早期已經發揮作用，是導致胰島素抵抗的重要的危險因素之一，也是糖尿病脂毒學說的重要內容〔1〕。氧化應激作為一種重要的病理生理過程，參與了胰島素抵抗的形成，同時也是糖尿病各種慢性并發癥的共同基礎〔2〕。褪黑素(MT)是由松果體分泌的一種神經激素，可以通過各種膜結構進入細胞發揮強大的抗氧化、抗自由基功能〔3〕。本研究觀察并分析MT對人胚胎干細胞L02細胞形成胰島素抵抗的防護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 PA、MT、2＇，7＇-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)、無血清白蛋白(BSA)等購自Sigma公司(USA)；胎牛血清(浙江三利公司)；RPMI-1640培養基(Gibco，USA)；磷酸化JNK(Thr183/Tyr185)和β-actin鼠多克隆抗體、磷酸化胰島素受體(IR)(Tyr1162/1163)兔多克隆抗體、磷酸化IR底物(S)1/2(Tyr612) 兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養 將L02細胞接種于含10%滅活胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養液中，置37℃、飽和濕度5%CO2培養箱中孵育。當細胞80%長滿或接近匯合成片時則進行傳代。吸出培養瓶內舊培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞一次，然后加入胰蛋白酶溶液少許進行消化，以能覆滿瓶底為限。在室溫中，于倒置顯微鏡下觀察，當發現細胞胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。吸除消化液，加入培養液，用吸管吸取培養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。將細胞懸液分為三等份裝入三個培養瓶中，置于37℃恒溫培養箱中培養。

1.3 細胞分組與處理 所有實驗均采用處在對數生長期的L02細胞進行實驗。將已傳代培養的細胞培養2 d左右時間，吸出培養瓶內舊培養液，用PBS洗滌細胞3次。對照組(BSA組)換含相應濃度的BSA的無血清的RPMI-1640培養液培養，PA組換含實驗濃度的PA的無血清RPMI-1640培養液培養，PA+MT組換含10 μmol/L MT和0.3 mmol/L PA的無血清RPMI-1640培養液培養，PA+維生素VitC)組換含1 mmol/L VitC和0.3 mmol/L PA的無血清RPMI-1640培養液培養，培養時間根據實驗需要。

1.4 細胞中活性氧自由基(ROS)的測定 根據實驗處理L02細胞后，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37℃孵育20 min以后收集細胞至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS吹散細胞，重復洗2遍，棄去未反應的DCFH-DA。每管沉淀內加入300 μl PBS吹散細胞，避光。用熒光分光光度計檢測細胞內的平均熒光強度，激發波長488 nm，發射波長530 nm，細胞進行蛋白定量。根據細胞內DCF的熒光強度，可反映出細胞內ROS的濃度。

1.5 Western 印跡檢測信號蛋白磷酸化水平 L02細胞分3組(BSA對照組，0.3 mmol/L PA處理組，0.3 mmol PA+10 μmol/L MT處理組)培養24 h。各組細胞棄培養液，用預冷PBS洗滌3次。各組細胞換以含10-6mol/L胰島素的新鮮無血清RPMI-1640培養液，溫育15 min。收集細胞，用細胞裂解液冰上作用20 min。超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心25 min。取上清液用BCA法測定蛋白質濃度。將蛋白質與等體積的5倍上樣電泳緩沖液混合，煮沸5 min。調整蛋白質含量為60 μg/孔上樣進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，于4℃下300 mA電轉印1 h至硝酸纖維素膜，加入3%BSA封閉液，4℃封閉過夜。棄去封閉液，加入用3% BSA，按1∶500稀釋的一抗，4℃封閉過夜。棄去雜交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，加入3% BSA稀釋二抗(堿性磷酸酶標記驢抗兔，稀釋度1∶1 000)，37℃孵育90 min。棄去雜交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，將膜浸入NBT/BCIP顯色液中，室溫下放置20 min左右，待條帶顯色清楚后用水沖洗，將條帶拍照掃描定量并進行圖像分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS11.5統計學軟件進行方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 PA影響L02細胞胞內ROS含量的劑量變化關系 用不同濃度(0、0.1、0.3、0.5 mmol/L)的飽和脂肪酸PA處理L02細胞24 h，測定細胞內的ROS含量，分別為(20.5±2.33)、(29.3±3.37)、(42.8±4.15)、(46.1±4.37)相對熒光度/mg蛋白。ROS含量呈現明顯的濃度依賴關系(P<0.05)。

2.2 PA影響L02細胞胞內ROS含量的時間變化關系 用0.3 mmol/L的PA處理L02細胞不同時間(0、2、6、12、24、36 h)，結果顯示ROS含量存在明顯的時間依賴關系〔分別為(20.7±2.34)、(18.8±2.25)、(23.3±2.79)、(29.6±3.14)、(41.5±4.63)、(34.6±4.17)相對熒光度/mg蛋白〕，在24 h達到最高，并在36 h后仍維持較高水平(P<0.05)。

2.3 MT和Vit C對L02細胞胞內ROS含量的影響 與BSA組(21.34±2.41 相對熒光度/mg 蛋白)相比，PA組(46.62±4.54相對熒光度/mg 蛋白)的ROS含量明顯升高(P<0.05)；PA+MT組(21.34±2.41相對熒光度/mg 蛋白)ROS含量明顯低于PA組(P<0.05)；PA+MT組與BSA組相比，ROS含量沒有顯著差異(P>0.05)；PA+VitC組(34.16±3.82相對熒光度/mg 蛋白)與PA組相比，ROS的含量減少，但仍高于PA+MT組(P<0.05)，表明MT比VitC有更強的清除ROS能力。

2.4 PA和MT處理對L02細胞內胰島素通路中信號蛋白磷酸化水平的影響 PA組與BSA組相比，Y-p-IR(灰度值0.63±0.12 vs 1.00±0.20，P<0.05)和Y-p-IRS1/2磷酸化水平減少(灰度值0.71±0.15 vs 1.00±0.19，P<0.05)；PA+MT組與PA組相比，Y-p-IR和Y-p-IRS1/2磷酸化水平升高(灰度值0.85±0.16，灰度值0.94±0.16 vs 0.71±0.15，均P<0.05)。見圖1。

2.5 PA和MT處理對L02細胞內蛋白激酶JNK磷酸化水平的影響 PA組與BSA組相比，p-JNK磷酸化水平升高(灰度值1.46±0.28 vs 1.00±0.18，P<0.05)；PA+MT組與PA組相比，p-JNK磷酸化水平減少(灰度值1.16±0.21，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測L02細胞信號蛋白和激酶的磷酸化水平

3 討 論

研究表明，血漿中FFA濃度增高是引起胰島素抵抗和T2DM的重要危險因素之一〔4，5〕。高FFA能夠通過線粒體解耦聯、β氧化、氨基己糖途徑的激活引起線粒體活性氧ROS的形成〔6〕。研究證實，ROS是機體多種因素誘導胰島素抵抗的共同途徑，在胰島素抵抗發生發展中發揮重要作用〔7〕。本研究發現，用不同濃度的飽和脂肪酸PA孵育L02細胞24 h，細胞內的ROS含量明顯升高，呈濃度依賴性，這種現象與Frankie等〔8〕在血管內皮細胞中和Duvala等〔9〕在肌細胞中觀察的結果一致。ROS的生成量還與FFA孵育時間有關，隨著孵育時間的延長，細胞內ROS水平逐漸增高，在24 h達到高峰，并且在36 h仍維持在高水平。本實驗結果表明，高濃度的FFA能夠在L02細胞中誘導ROS的生成，過量的ROS可破壞細胞的抗氧化防御體系，使細胞產生氧化應激，從而造成細胞損傷，這也是過量FFA脂毒性的重要內容。MT具有復雜而廣泛的生理藥理作用，它能維持晝夜節律、促進睡眠，能增強人體免疫功能，對生長發育、性功能、內分泌和胞內信號也具有調節功能〔10〕。很早的研究發現〔11〕，MT具有強大的抗氧化作用，是目前已知的體內抗氧化作用最強的自由基清除劑。本研究顯示，補充抗氧化劑能明顯減少高MT導致的細胞內ROS升高，其中MT清除ROS能力遠遠大于抗氧化劑VitC，使細胞中PA產生的高濃度ROS恢復到正常水平，本研究結果在L02細胞中進一步證實了MT強大的抗氧化清除自由基ROS能力。

在肝細胞，胰島素與IR的α亞基結合后，引起受體β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化，通過激活IR胞質段酪氨酸激酶識別募集IRS家族的各個成員，將IRS蛋白多個位點酪氨酸殘基磷酸化，后者再與含有SH2結構域的多種蛋白結合，通過RAS/MAPK、PI3K/PKB和PKC等途徑傳導從而調節肝細胞蛋白質合成、脂質代謝、糖代謝、細胞生長和分化等。在胰島素信號轉導的諸多環節中任何部分的異常，均會造成胰島素受體信號轉導缺陷，可能導致胰島素抵抗的發生〔12〕。研究表明，肥胖伴胰島素抵抗和T2DM患者的多種組織細胞IR的酪氨酸激酶活性是降低的。在內皮細胞中，高濃度FFA可以通過抑制PKB等信號通路影響胰島素的信號傳導〔13〕，而在高脂喂養及ob/ob肥胖大鼠中發現，肌肉的胰島素抵抗與IRS的缺陷密切相關〔14〕。

應激敏感激酶c-Jun氨基末端激酶(JNK)在細胞分化、細胞凋亡、應激反應及多種疾病的發生與發展中起著至關重要的作用。JNK對細胞內的ROS非常敏感，ROS升高引起的氧化應激能夠激活JNK，活化應激敏感信號通路，作用于不同的組織器官，能最終導致胰島素抵抗、β細胞功能紊亂、糖尿病并發癥的出現〔15〕。JNK屬于絲/蘇氨酸磷酸化激酶，可使IRS絲氨酸磷酸化，阻礙正常的酪氨酸磷酸化，導致正常的酪氨酸磷酸化受抑制，影響胰島素受體與IRS的結合，最終減弱IRS介導的胰島素信號傳遞，導致胰島素抵抗。Nguyen等〔16〕和Solinas等〔17〕分別在脂肪細胞和肝細胞中證實，JNK能被FFA激活，活化的JNK是FFA誘導細胞胰島素抵抗的主要中介體，而使用JNK的肽抑制劑或敲除JNK基因阻止IRS1的Ser307的磷酸化，增強胰島素信號傳遞，改善了胰島素抵抗狀態〔18，19〕。

本研究提示胰島素信號傳導在上游已經受損，因IR信號轉導缺陷是胰島素抵抗發生的主要原因，這也表明L02細胞已經出現了胰島素抵抗。ROS引起的氧化應激減少后，JNK的活化作用減弱，同時，胰島素信號傳遞功能卻得到增強，胰島素信號上游的多處受損的信號分子如IR、IRS酪氨酸磷酸化水平升高，活性部分增強，這標志胰島素信號轉導功能得到改善，因此，MT對PA誘導的干細胞胰島素抵抗具有有效的防護作用。

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〔2016-01-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南科技大學創新能力培育基金(No.2012ZCX024)

席守民(1968-)，男，碩士，教授，碩士生導師，主要從事疾病及藥物的分子基礎研究。

萬學東(1966-)，男，博士，副教授，主要從事信號轉導與疾病的研究。

R961

A

1005-9202(2017)13-3183-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.026

1 天津市東麗區中醫醫院外科