慢病毒攜帶的短發夾RNA對乳腺癌細胞乙酰肝素酶基因表達的沉默作用

陳國利 鄭志方 李 巍 張學軍

(承德醫學院附屬醫院外一科，河北 承德 067000)

慢病毒攜帶的短發夾RNA對乳腺癌細胞乙酰肝素酶基因表達的沉默作用

陳國利 鄭志方1李 巍 張學軍

(承德醫學院附屬醫院外一科，河北 承德 067000)

目的 通過構建短發夾RNA(shRNA)慢病毒載體，轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞，探討慢病毒攜帶的shRNA對乳腺癌細胞乙酰肝素酶(HPA)基因表達的沉默作用。方法 采用RNA干擾(RNAi)序列設計原則，以乳腺癌HPA基因為靶基因，將構建5對shRNA重組慢病毒載體，轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過Western印跡檢測HPA-shRNA對MDA-MB-231細胞HPA蛋白表達水平的影響；用CCK-8的方法檢測HPA-shRNA對乳腺癌細胞的生長抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)對乳腺癌細胞的殺傷作用，運用transwell實驗檢測HPA-shRNA對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。進一步，運用流式分析的方法檢測HPA-shRNA對乳腺癌細胞周期的影響。建立小鼠轉移瘤模型，檢測HPA-shRNA在體內對乳腺癌細胞的生長抑制作用。結果 成功構建HPA-shRNA重組慢病毒載體。在體外，實驗組HPA-shRNA1組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組有效沉默了人乳腺癌MDA-MB-231細胞HPA的表達，HPA蛋白表達明顯降低(P<0.05)。HPA-shRNA1對乳腺癌細胞的生長具有良好的抑制作用，HPA-shRNA1能夠增加乳腺癌細胞對5-Fu的敏感性。此外，HPA-shRNA1能夠誘導乳腺癌細胞在S期發生細胞周期阻滯。在體內，HPA-shRNA1組HPA基因mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組(P<0.05)，HPA-shRNA1能夠沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表達。在體內HPA-shRNA1同樣能夠抑制乳腺癌細胞生長。結論 HPA-shRNA重組慢病毒載體可有效抑制乳腺癌HPA基因的表達，進而發揮良好的抗腫瘤作用。

乙酰肝素酶；乳腺癌；慢病毒載體；短發夾RNA；MDA-MB-231細胞

新發乳腺癌患者逐年遞增〔1〕，其復發和轉移一直是腫瘤科的難題，嚴重影響患者療效。研究乳腺癌復發轉移機制為臨床采取有針對性的防治措施，防止乳腺癌復發和轉移，減輕患者的痛苦，延長患者的生存期具有重要的意義。乙酰肝素酶(HPA)是一種能夠裂解細胞表面和細胞外基質的β-D葡萄糖醛酸酶，HPA的活性與腫瘤的轉移和血管生成密切相關〔2〕。HPA的高表達與乳腺癌的復發轉移密切相關〔3〕。本研究采用RNA干擾(RNAi)技術，構建HPA-短發夾RNA(shRNA)重組慢病毒表達載體，通過在體內外實驗研究靶向沉默乳腺癌HPA基因的表達，為乳腺癌的基因靶向治療尋找新的靶點。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 慢病毒包裝293T細胞和乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自上海中科院細胞庫，L-15培養基和胰酶購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，鼠單克隆HPA抗體購自Abcam公司，慢病毒系統(轉移載體、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四質粒) 由上海吉瑪制藥技術有限公司提供，Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，SYBR Premix Ex Taq熒光實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，BCA蛋白質定量試劑盒購自碧云天公司，健康BALB/C雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.2 體外實驗

1.2.1 乳腺癌MDA-MB-231細胞培養 乳腺癌MDA-MB-231細胞株接種L-15培養基中，置于5%CO2，37℃培養箱培養。

1.2.2 靶向HPA-shRNA序列設計 以HPA基因為靶基因，根據shRNA序列計基本原則設計出的shRNA序列分別為：HPA-shRNA1：5′GCTGCCTAGATGTGCGCCTATACA3′；HPA-shRNA2：5′GCATAACTACTATTTATTGAATGG3′；HPA-shRNA3：5′GCACGGGTGCAAGGTATTTCAAAG3′；HPA-shRNA4：5′GCTGCCCAGCTTTCTTGGCATATA3′；HPA-shRNA5：5′GGAGCCACAAGCTCTACCGCATAT3′；陰性對照：5′GTTGCCCGAACGTGTGAACACGT3′。

1.2.3 HPA-shRNA慢病毒表達載體的構建 將合成寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA，PCR擴增、回收、純化。雙鏈DNA經T4 DNA連接酶與線性化質粒連接，轉化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆進行測序鑒定。

1.2.4 HPA-shRNA重組慢病毒的包裝和滴度測定 用10%胎牛血清(FBS)+杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)對293T細胞進行培養。當細胞密度達到約80%進行細胞傳代，把細胞平均分到3個25 cm2培養皿中過夜。細胞密度達到70%～90%開始轉染，病毒包裝質粒和HPA基因RNAi序列重組質粒轉染293T細胞，轉染72 h后收集上清液，離心過濾并濃縮得到慢病毒液，分裝保存在-80℃。病毒原液10 μl用10倍有限稀釋法稀釋后依次浸染293T細胞，72 h后觀察綠色熒光蛋白表達情況，可測出慢病毒原液滴度。

1.2.5 MDA-MB-231細胞轉染HPA-shRNA重組慢病毒效果檢測 細胞分為6組：①HPA-shRNA1組；②HPA-shRNA2組；③HPA-shRNA3組；④HPA-shRNA4組；⑤HPA-shRNA5組；⑥陰性對照組。①～⑥MDA-MB-231細胞組分別轉染HPA shRNA1、2、3、4、5、陰性對照組慢病毒。將轉染后的細胞培養72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.6 Western印跡檢測HPA的表達 轉染72 h，PBS洗滌細胞，通過RIPA裂解液裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，考馬斯亮藍法蛋白定量，電泳分離，轉到PVDF膜封閉，2 h后加入HPA單克隆抗體，4℃溫育過夜，洗滌后加入稀釋的二抗，室溫溫育2 h后顯色，以GAPDH作為內參照，凝膠成像系統分析。

1.2.7 CCK-8試劑盒檢測細胞活性 取適當濃度的細胞懸液在96孔板中接種細胞(100 μl/孔)。將培養板放在細胞培養箱中培養(37℃，5%CO2)。分別于1，2，3，4 d，向每孔加入10 μl CCK-8溶液。③將培養板在培養箱內孵育1～4 h。用酶標儀測定每個孔在450 nm處的吸光度。

1.3 體內實驗

1.3.1 實驗動物分組 采用健康BALB/C雌性裸鼠，將裸鼠隨機分2組(實驗HPA-shRNA1組、陰性對照組)，每組4只，構建乳腺癌皮下移植瘤模型。

1.3.2 構建腫瘤模型 MDA-MB-231細胞配成1×109細胞/ml懸液，取0.2 ml注射裸鼠右側腋窩，裸鼠右側腋窩出現一個球形凸起。觀察腫瘤的生長情況。

1.3.3 HPA-shRNA重組慢病毒注射 將體外實驗篩選的沉默MDA-MB-231細胞HPA表達的HPA-shRNA1序列包裝成重組慢病毒。當腫瘤直徑約10 mm，攜帶HPA-shRNA1、HPA-陰性對照的重組慢病毒分別注射各組裸鼠移植瘤，隔日1次，分4次，每只裸鼠總量400 μl，觀察MDA-MB-231細胞生長情況、5-氟尿嘧啶(5-FU)對細胞生長的影響及細胞周期情況。

1.3.4 實時定量PCR檢測裸鼠乳腺癌移植瘤HPA mRNA的表達 HPA-shRNA重組慢病毒注射裸鼠移植瘤1個月，將每組裸鼠分別逐一編號，共2組，每組4只。手術剝離出移植瘤，實時定量PCR檢測HPA mRNA表達。提取總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA含量，瓊脂糖凝膠電泳得到5.8 S、18 S、28 S三條帶，提取的RNA純度良好。按照實時定量PCR試劑盒進行檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1 HPA-shRNA表達載體構建和測序 構建的特異性靶向抑制人HPA基因的5個重組慢病毒表達載體HPA-shRNA1、2、3、4、5，經測序鑒定證實插入的堿基序列與設計的5個HPA-shRNA序列完全一致，表明成功構建了HPA-shRNA重組慢病毒表達載體。

2.2 乳腺癌MDA-MB-231細胞轉染HPA-shRNA重組慢病毒效果檢測 用人乳腺癌MDA-MB-231細胞轉染HPA-shRNA重組慢病毒，轉染72 h后可見大多數MDA-MB-231細胞表達熒光蛋白(圖1)，證明轉染效率較高。

2.3 Western印跡檢測HPA蛋白表達 HPA-shRNA1組、HPA-shRNA2組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組、HPA-shRNA5組、陰性對照組HPA蛋白相對表達水平分別為0.023±0.015、0.447±0.140、0.083±0.035、0.033±0.015、0.917±0.075、0.947±0.051。HPA-shRNA1組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組HPA蛋白的表達明顯低于陰性對照組(P<0.05)，表明HPA-shRNA1、HPA-shRNA3、HPA-shRNA4能夠下調HPA基因蛋白表達，見圖2。

圖1 轉染72 h前后MDA-MB-231細胞熒光圖片(×200)

1、HPA-shRNA1組；2、HPA-shRNA2組；3、HPA-shRNA3組；4、HPA-shRNA4組；5、HPA-shRNA5組；6、陰性對照組圖2 Western印跡檢測HPA蛋白的表達

2.4 HPA-shRNA1抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的生長 與陰性對照組相比，MDA-MB-231轉染HPA-shRNA1組的細胞生長緩慢，增殖率顯著低于陰性對照組，HPA-ShRNA1組第2，3，4天OD值分別為0.741±0.059，0.833±0.063，0.926±0.069，陰性對照組第2，3，4天OD值分別為1.173±0.045，1.341±0.061，1.512±0.091，自第2天起兩組OD值有顯著差異(P<0.05)，說明隨著培養時間的延長，轉染HPA-shRNA1的MDA-MB-231細胞增殖能力被顯著抑制。

2.5 HPA-shRNA1增強5-Fu對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的殺傷作用 與陰性對照組相比，5-Fu能夠顯著抑制轉染HPA-shRNA1 的MDA-MB-231細胞的增殖能力，并且隨著5-Fu濃度的增加，對MDA-MB-231細胞增殖能力的抑制率增強。0.400、2.000、10.000、50.000、250.000 μg/ml時，HPA陰性對照組OD值分別為1.539±0.077、1.337±0.049、0.949±0.055、0.631±0.032、0.315±0.021，而且HPA-shRNA1組OD值分別為0.956±0.055、0.598±0.023、0.551±0.042、0.332±0.054、0.100±0.013，均顯著低于對照組(P<0.05)。

2.6 HPA-shRNA1抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的侵襲能力 兩組細胞中，均有部分細胞能穿過transwell小室底部的8 μm小孔，轉染空載病毒的陰性對照組細胞穿過小孔的細胞數量明顯高于轉染HPA-shRNA1組。因此，HPA-shRNA1能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力。見圖3。

圖3 HPA-shRNA1抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲能力

圖4 兩組裸鼠移植瘤生長情況

2.7 HPA-shRNA1誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞周期阻滯 乳腺癌細胞轉染HPA-shRNA1病毒孵育72 h后，用流式分析的方法檢測乳腺癌細胞的周期，陰性對照組細胞G1、G2、S期比例分級為：70.57%、2.2%、27.23%；HPA-shRNA1組細胞G1、G2、S期比例分別為59.31%、1.41%、39.82%。與陰性對照組細胞相比，HPA-shRNA1組細胞發生顯著的S期細胞阻滯。

2.8 HPA-shRNA1在體內抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖及移植病內HPA mRNA表達水平 如圖4。觀察兩組小鼠腫瘤的生長情況，30 d后，將轉染HPA-shRNA1和空載的病毒的小鼠腫瘤取出，HPA-shRNA1能夠顯著抑制乳腺癌細胞在小鼠體內生長見圖4。HPA-shRNA1組HPA mRNA相對表達量(0.183±0.075)明顯低于陰性對照組(0.933±0.206，P<0.05)；表明在體內實驗，HPA-shRNA1能夠下調乳腺癌移植瘤HPA mRNA表達。

3 討 論

腫瘤的轉移仍然是癌癥患者的主要死亡原因。研究表明〔4〕，腫瘤的轉移與多種蛋白酶有關，如金屬蛋白酶、HPA等。HPA作為葡萄糖醛酸酶，是一種哺乳動物糖類內切酶，能夠降解細胞表面和細胞外基質的硫酸類肝素蛋白多糖促進腫瘤轉移，在大多數人類腫瘤細胞中高表達〔5～8〕。而在人類正常組織，HPA含量低表達，主要分布肝細胞、血小板、巨噬細胞、淋巴細胞等〔9〕。HPA有兩種形式，即HPA和HPA2，其中HPA和腫瘤侵襲有關，而HPA2調節其活性，其活性在惡性腫瘤高于良性腫瘤〔10〕。人類HPA的前體是一種由543個氨基酸組成的蛋白質，這種蛋白質的活化與切除一個內部連接片段有關，切除后產生具有活性的異質二聚體，切除位于兩個功能組織蛋白酶連接片段的C端的10個氨基酸是激活HPA前體的關鍵〔11〕。

HPA和血管內皮生長因子(VEGF)-C是重要的細胞因子，促進許多惡性腫瘤的轉移和血管生成，腫瘤通過釋放降解基底膜(BM)和細胞外基質(ECM)的酶促進腫瘤轉移〔12〕。HPA的活性和腫瘤細胞的轉移潛能密切相關，其能夠裂解和破壞上皮細胞和內皮細胞的ECM和BM的HS側鏈，提高腫瘤細胞的播散能力。研究表明，HPA的表達可以減少細胞核syndecan-1的含量，增加組蛋白乙酰轉移酶(HAT)的活性，從而上調侵襲性腫瘤相關基因的轉錄水平〔13〕。HPA作為侵襲性腫瘤相關蛋白的激活蛋白，在一定程度上提高了腫瘤相關蛋白的表達，如血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶-9等。HPA的β-D葡萄糖醛酸酶活性和血管內皮細胞的遷移、黏附和免疫細胞的激活密切相關，從而參與新血管形成、炎癥反應和自身免疫反應〔5〕。

HPA與多種腫瘤的轉移密切相關，如淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、骨肉瘤、肝癌、黑色素瘤等〔14～19〕。另外，HPA在乳腺癌中高表達，而在癌旁正常組織低表達〔20〕。因此，以HPA為抗原，研究以HPA為靶點的腫瘤疫苗是治療腫瘤轉移的有效方法，然而，單一腫瘤疫苗的免疫激發功能較低，需要佐劑提高其免疫激發功能，甲殼低聚糖已被證明是一種有效的以HPA為靶點的腫瘤疫苗佐劑〔21〕。

慢病毒載體是能傳遞遺傳物質進入細胞的重要的工具〔22〕。為了將目的基因導入靶細胞，采用合適的載體是腫瘤基因靶向治療的關鍵之一，慢病毒是基因轉移成熟載體，慢病毒載體廣泛應用于基因轉移和基因治療〔23〕。與其他載體相比具有獨特優勢：①轉染效率高〔24〕；②對分裂細胞和非分裂細胞均具有轉染作用，并能夠使目的基因在靶細胞穩定表達，且具有安全、低毒、高穩定性。本研究表明慢病毒作為shRNA轉移載體是可行的。

RNAi參與天然免疫反應，可以保護細胞免受病原體(如病毒和細菌)的入侵，沉默同源目標靶基因的轉錄后表達〔25〕。RNAi通過不同的信使RNA降解途徑沉默目標基因的表達，RNAi主要通過三種方式進行基因調控：微小RNA(microRNA)、shRNA和小干擾RNA(siRNA)〔26〕。

有研究表明，抑制HPA的表達能夠抑制結直腸癌腫瘤細胞的生長〔27〕，本研究證實了在乳腺癌中，應用HPA-shRNA降低HPA在乳腺癌MDA-MB-231細胞的表達，能夠抑制其增殖和侵襲能力。目前5-Fu廣泛應用于乳腺癌的治療，但是，耐藥不僅降低乳腺癌患者的生存期，同時降低患者的生活質量〔28〕，本研究證實，HPA-shRNA1能夠增強5-Fu對MDA-MB-231細胞的殺傷能力，增強化療藥物的敏感性，為乳腺癌耐藥患者提供了新的治療途徑，可能是由于HPA與細胞周期相關〔29〕。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

承德市科學技術研究與發展計劃項目(No.20151029)

陳國利(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事乳腺腫瘤治療的研究。

R655.8

A

1005-9202(2017)13-3169-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.021

1 承德醫學院附屬醫院小兒內科