中藥材指紋圖譜研究進展

袁琴琴

摘要 詳細概述了中藥材指紋圖譜的概念、特點、研究現狀、建立方法和評價方法，為指紋圖譜技術在中藥材上的應用提供了一定參考。

關鍵詞 指紋圖譜；研究現狀；建立方法；評價方法

中圖分類號 R284.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0132-03

Research Progress on Fingerprint of Traditional Chinese Medicine

YUAN Qin-qin

（Life Sciences Department of Heze University， Heze， Shandong 274000）

Abstract The concept， characteristics， research status， establishment and evaluation method of fingerprint of traditional Chinese medicine were reviewed in detail， which will provide a certain reference for application of fingerprint technology in traditional Chinese medicine.

Key words Fingerprint；Research status；Establishment method；Evaluation method

我國中藥材品種眾多，資源豐富，為了更好地控制中藥材質量，確保用藥安全，進一步實現中藥的現代化和國際化，如何找到一個既符合中醫臨床傳統用藥習慣，又能很好地保證中藥材內在特性，進而提高現行中藥質量標準的技術含量，一直是人們研究的熱點[1]。隨著現代分析測試技術的發展，質量控制方法已經從傳統的手摸、眼觀等感官檢查發展到理化鑒別、顯微鑒定、光譜和色譜等技術進行中藥材質量控制[2-3]。目前，中藥指紋圖譜技術作為中藥材質量控制的方法已成為一種國際共識，在中成藥生產、檢驗和研究過程中發揮著越來越重要的作用[4]。筆者對中藥材指紋圖譜的概念、特點、研究現狀、建立方法、評價方法進行詳細的概述，以期為指紋圖譜技術在中藥材上的應用提供參考。

1 中藥指紋圖譜的概念及特點

1.1 概念

中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥經過適當的處理后，運用現代分析技術對其化學成分的信息進行表征并加以描述，進而得到能夠標志該中藥材或中成藥特征的色譜圖或光譜圖，是一種綜合的、可量化的化學鑒定手段。中藥指紋圖譜可以鑒別某種藥材真偽或產地的“共性”，并且可以評價這種藥材或中藥材半成品的質量的穩定性、真實性以及優良性，它強調的是同一中藥材的相似性，而不強調個體的唯一性[5-6]。因此中藥指紋圖譜對于促進中藥材的現代化發展和提高其質量具有十分重要的作用。

1.2 特點

1.2.1 系統性。系統性是指指紋圖譜中所顯示出來的信息包含了這種藥材的大部分成分。

1.2.2 特征性。特征性是指指紋圖譜中所顯示出來的諸如保留時間、相對保留時間等信息應具有的較強的選擇性。這些信息經過綜合的分析后，能夠區分該中藥材的優劣、來源以及判別真偽，使這一指紋圖譜能夠成為某一中藥材的“化學條碼”。

1.2.3 穩定性。穩定性是指所建立的指紋圖譜在規定的方法、條件下，即不同操作者、不同實驗室所重復做出的指紋圖譜應在所允許的誤差范圍內，以體現其通用性和實用性。只有圖譜的特征峰能保持相對的穩定，才能有效控制其樣品的質量[7-8]。

2 指紋圖譜的發展現狀

近年來，中藥質量的控制已從化學成分定量分析發展到整體質量評價的階段，因此在中藥質量綜合評價過程中指紋圖譜技術就起到了十分重要的作用[9]。20世紀80年代中藥指紋圖譜技術就已經用于中藥質量的檢測，如采用薄層色譜、紅外光譜等來制訂某種中藥材或中成藥的指紋圖譜[10]。隨著中藥現代化的深入發展，中藥指紋圖譜引起中藥領域科研人員的極大關注[11]。2001年在廣州舉行的有關指紋圖譜的研討會議起了引導作用，促使國家藥品監督管理局正式將指紋圖譜的研究納入考察某一中藥材質量標準的行列中[12]。在國外，許多國家也將指紋圖譜的技術作為中藥質量控制的手段，日本在20世紀80年代就使用高效液相指紋圖譜作為控制中藥材質量的方法，在印度和美國的草藥典也將指紋圖譜作為評價中藥材質量好壞的方法之一。因此，運用中藥指紋圖譜的方法控制中草藥質量已經被國際公認[13-16]。

3 中藥指紋圖譜建立的方法

3.1 紫外光譜法（UV）

紫外光譜法較適用于中藥材內含有較強紫外吸收能力的物質，但中藥材化學成分復雜，紫外光譜各吸收峰疊加現象明顯，特征性不足。因此可通過導數光譜尋找隱藏的吸收峰，從而提高紫外光譜法的特征性和分辨率[17]。徐瀾等[18]利用紫外光譜法測定了酪氨酸的含量，結果較為滿意。

3.2 紅外光譜法（IR）

紅外光譜法是對藥品鑒定的一種權威的分析技術，它的原理是利用物質的分子對紅外輻射的吸收能夠得到與分子結構相似的紅外光譜圖。紅外光譜有很高的特征性，每一個化合物都有其獨特的紅外光譜。然而對中草藥而言，每一種藥材的成分都非常復雜，它的紅外光譜就是疊加所有化學成分的紅外光譜。傅興圣等[19]利用紅外光譜法建立了13個地點的生磁石樣品的指紋圖譜，結果表明，13批生磁石樣品的共有峰在指紋圖譜上均有體現，通過夾角余弦法計算其相似度較好，可以為磁石的質量評價提供一定的依據。

3.3 核磁共振指紋圖譜

核磁共振方法的原理是利用中藥材有效成分中特定的元素原子，用其吸收電磁的輻射進而得到這種藥材的核磁共振指紋圖譜，在色譜圖中的縱坐標則為峰的強度，橫坐標為吸收的頻率。這種方法所需樣品量少、掃描的時間短，而且結果具有很高的重復性和穩定性[20]，因此在中藥指紋圖譜中這種方法的應用比較廣泛。孫慶雷等[21]利用核磁共振指紋技術獲得黃芩提取物的指紋圖譜，試驗結果表明，此方法建立的不同批次黃芩的核磁共振指紋圖譜重復性和特征性都較好，可以為黃芩鑒別真偽提供依據。

3.4 薄層色譜（TLC）指紋圖譜

薄層色譜法具有操作簡便、快速分離、檢測時間易于掌控等優點，是最早也是現在最普遍的一種研究中藥指紋圖譜的方法。這種方法的原理是將吸附劑涂于薄層板上，使其成為一個均勻薄層，然后將供試品溶液用毛細管點樣，干燥后將薄層板放入含有合適展開劑的展開槽內，以使供試品所含的成分分離，按同樣的方法處理對照物，對中藥材的質量進行評價[22-23]。在《中華人民共和國藥典》中有很多的藥材是選用薄層色譜的方法來鑒別，但薄層板的制備、展開劑的配比比例等諸多的因素對薄層色譜檢測有一定的影響，這就限制了薄層色譜方法在中藥材研究中的應用[24]。丁平等[25]利用薄層色譜法建立了靈芝三萜類化合物的薄層色譜指紋圖譜，取得了較滿意的結果。

3.5 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜是以液體為流動相的，采用高壓輸送系統，根據不同的化學成分在流動相和固定相吸附、解吸附的能力不同而達到分離目的的一種方法。高效液相色譜具有適用范圍廣、高速、高效、靈敏、重現性好的優點，并且不受樣品沸點、穩定性、分子量大小的限制，因此在藥物分析、食品分析、污染分析、化工分析以及生物制藥領域中應用非常廣泛，在《中華人民共和國藥典》中共有超過約400種的中藥質量控制和超過600種化學合成藥物應用高效液相色譜法[26-27]。

高效液相采用很多新型的檢測器，其中最常見的是二極管陣列檢測器，利用這種檢測器可得到某種成分的三維圖譜，因此這種技術更適用于分析多種復雜成分在紫外光區均有吸收的藥物；另外，高效液相的方法和質譜技術的聯用使其靈敏度得到顯著提高，這種技術使HPLC高效的分離能力與質譜（MS）的高度選擇性、靈敏性相結合，因此不但彌補了紫外檢測的不足，還可以提供化學成分的結構信息，為進一步分析復雜樣品的成分分析成為可能[28-29]。基于以上的優點，高效液相色譜法已廣泛用于中藥指紋圖譜的建立，作為其質量控制的標準為中藥材的鑒別以及質量的評價提供了更全面和可靠的依據[30]。馬金花等[31]采用色譜柱 PLATISIL ODS（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm）、甲醇-0.2%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，建立了重慶不同產地杜仲葉的HPLC指紋圖譜，結果顯示，HPLC方法具有很好的重現性、穩定性，因此可以為控制杜仲葉的內在品質提供有效可靠的依據。

3.6 氣相色譜（GC）指紋圖譜

氣相色譜以氣體為流動相，具有高效、高靈敏、高選擇性、進樣量少等優點，主要用于含有揮發性成分物質的鑒別。通常與質譜技術聯用，這種聯用技術不但可以區分不同中藥材中揮發性成分的差異，還可以鑒定被檢測成分的結構，缺點是僅適用于低沸點的物質[32]。

田吉等[33]采用GC-MS的方法建立了11批金銀花藥材的氣相色譜指紋圖譜，通過試驗結果得出該方法有較好的穩定性和重復性，并對11批金銀花藥材進行了相似度分析，為評價金銀花品質提供了一定的依據。

3.7 高速逆流色譜（HSCCC）指紋圖譜

高速逆流色譜法是國際上一種新型的液-液分配的逆流色譜技術[34]，此方法不使用固相的載體作固定相，因此克服了固相載體帶來的樣品損失、吸附、峰形拖尾、污染等缺點。高速逆流色譜法具備回收率高、超載制備能力強的優點，因此特別適合用于分離極性大的化合物。現在HSCCC技術在國內對中藥材分析方面的應用還處于開始階段，但這一技術的應用前景非常廣闊[35-36]。顧銘等[37]采用HSCCC技術分離丹參脂溶性成分，并且通過分光光度計和液質聯用的技術對高速逆流方法分離出來的成分進行鑒定，結果顯示，建立中藥指紋圖譜時選用HSCCC法是可行的。

3.8 高效毛細管電泳（HPCE）指紋圖譜

HPCE方法是電泳和色譜結合起來的一項新型高效分離的色譜技術，也是目前發展最快的一種分離技術。它具有高柱效、速度快、進樣量小、抗污能力強、前處理簡單、成本低、選擇性強等優點。HPCE建立指紋圖譜有很多的優點，但也存在一定的不足，如重現性差，謝瑩等[38]提出采用對照品校正和保留指數等方法來提高高效毛細管電泳的重現性。程偉等[39]采用高效毛細管電泳法構建了5個不同產地連錢草的指紋圖譜，結果表明，這5批次連錢草藥材共有峰有16個，各個樣品圖譜的峰重疊率低于60.3%，主要化學成分種類和質量分數不同產地差異較大；該試驗的穩定性、重復性較好，可以作為控制連錢草藥材質量的方法。

3.9 DNA指紋圖譜

目前，DNA指紋圖譜技術發展迅速，這一方法采用的是PCR技術合成DNA片段，而不同生物樣品中DNA片段數目不等、大小也不相同，利用這種差異進行鑒別所形成的指紋圖譜稱為DNA指紋圖譜[40]。這一技術具有類似于人指紋的高變異性、簡單、穩定、多位點性的特點，因而自其誕生就引起了人們的高度重視，是中藥品種鑒別中一種非常準確而又可靠的技術[41-42]。目前，通常采用隨機擴增多態DNA、擴增片段長度多態性DNA、限制性內切酶片段長度多態性DNA進行中藥材DNA指紋圖譜的構建[43]。李明軍等[44]采用RAPD標記的方法，對17 種淫羊藿植物的DNA 指紋圖譜進行分析，結果表明，17種淫羊藿植物均具有各自特有的譜帶、共同擁有的譜帶和共同缺失的譜帶，這些譜帶可為淫羊藿物種的鑒別提供準確有效的資料。

4 中藥指紋圖譜的評價方法

如何對所得到的指紋圖譜進行分析，繼而獲得最全面有價值的信息，在指紋圖譜圖的研究工作中也是非常重要的。中藥指紋圖譜2個最基本的屬性是“整體性”和“模糊性”，因此對中藥指紋圖譜的評價時，首先應從指紋圖的“整體性”出發，即盡可能把圖譜中所包含全部信息顯示出來；“模糊性”的重點是指待測樣品與對照品圖譜之間的相似性，而不是完全一致的去追求細枝末節。

4.1 直觀分析比較法

這種方法是指應用標準品與待測樣品的圖譜外觀和所得試驗數據直接比較，這種方法通過視覺直接對比、分析和判斷，具有強烈的主觀性，此法僅適用于干樣品的定性快速鑒別或對圖譜中數據比較少的情況，但目前比較少采用此法進行指紋圖譜的評價。

4.2 相似度計算法

相似度計算法常用的2種方法是夾角余弦和相關系數法[45]。

夾角余弦法是將中藥材的指紋圖譜數據看作多維空間向量，是指指紋圖譜特征變量上的變化模式的相似度，它體現一種成比例相似性的關系，可以為中藥材鑒別真假相似性提供信息[46]。王龍星等[47]運用夾角余弦法對不同產地的11批吳茱萸的HPLC指紋圖譜進行了相似度評價，結果顯示，利用夾角余弦法能夠較好地評價11批吳茱萸指紋圖譜之間的相似性。夾角余弦法的計算公式如下：

Cir=mk=1Xik·Xrk（mk=1X2ik）（mk=1X2rk）

相關系數法與變量的單位無關，對各個特征的變量值不敏感，特征變量的變化模式受變量值相互間的差異影響不大。此方法是測量各個樣品之間在特征變量上的相似性狀的相似度，不但可鑒別樣品的真偽優劣，而且可以提供一定信息的相似度[48]。公式如下：

rir=mk=1（Xik-）（Xrk-）（mk=1（Xik-）2（mk=1（Xrk-）2

4.3 模式識別法

模式識別（Pattem recognition）是用機器替代人對事物進行分析、判別和描述，是從化學計量學分離出來的一種數學方法。它的作用是識別出某個樣品與其他樣品之間的關系，也就是說在一定觀測的基礎上把某種樣品劃分到屬于自己的模式中。它劃分的標準可以采用UV、HPLC、GC、MS等方法對樣品中所含化學組成成分進行測定，然后分類[49]。模式識別的結果是能夠對未知的樣品進行分類和歸屬，模式識別還能對無法直接測量物質隱含的性質進行辨別給定的事物或與其相似或相同的事物，模式識別也能夠理解成是模式分類，就是把樣品分幾類，然后判斷某種事物是屬于哪一類。模式識別可以使人們在即使影響因子非常多的情況下也能夠對多種問題進行恰當的處理，通過使用計算機的技術對數據進行整理總結，找出目標與眾多因子之間的特定聯系。

5 展望

目前，中藥指紋圖譜技術作為評價中藥材品質的最佳手段，越來越受到重視，但在建立指紋圖譜的過程中也存在著許多不穩定的因素[50]，如何減少這些因素的影響是建立相對穩定的指紋色譜有待解決的難題。首先樣品的采集地點、品種、預處理以及采收季節等原因對中藥材的化學成分都有一定的影響，因此對中藥材建立規范的GAP管理就顯得至關重要，如從進行藥材的選種、采收等方面都要進行嚴格的規范。其次對指紋圖譜方法學考察也是建立穩定指紋圖譜的必要條件。只有盡可能消除不穩定因素，才可以保證所建立的指紋圖譜具有重復性、專屬性和唯一性等[51]。

中藥指紋圖譜用于中藥材的研究還在初始的探索階段，雖然存在著一些問題，但隨著現代分析技術的不斷發展以及多學科的相互滲透等原因，中藥指紋圖譜將逐步能真正地反映中草藥利用的安全性，在中藥質量控制的領域有十分廣闊的前景。

參考文獻

[1] 萬德光.論中藥品質理論的繼承與創新[J].中藥與臨床，2010，1（1）：3-6.

[2] 喬傳卓，張漢明，宓鶴鳴.生藥學[M].上海：同濟大學出版社，1995.

[3] 孫文基，沙振方，嚴智慧.熒光光譜法鑒別中藥材[J].中國中藥雜志，1991，16（6）：326-328.

[4] 黃璐琦.展望分子生物技術在藥學中的應用[J].中國中藥雜志，1995，20（11）：643.

[5] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術與應用[J].中國中藥雜志，2001，26（10）：653-655.

[6] 馬虹，韋永勤，林佳任，等.中藥指紋圖譜的研究及進展[J].貴陽中醫學院學報，2004，26（2）：58-59.

[7] 謝培山.色譜指紋圖譜分析是中草藥質量控制的可行策略[J].中藥新藥與臨理，2001，12（3）：141-151.

[8] 蔡寶昌，潛揚，殷武.指紋圖譜在中藥研究中的應用[J].世界科學技術：中醫藥現代化，2000，2（5）：191-196.

[9] 任德權.中藥質量控制的里程碑：中藥指紋圖譜[J].中成藥，2001，23（1）：1-3.

[10] 高祥寶.數據分析與SPSS軟件的應用[M].北京：清華大學出版社，2008：313.

[11] 謝培山.芻議中藥指紋圖譜的現狀、發展和問題[J].中藥材，2007，30（3）：257-259.

[12] 韓曄華，霍飛鳳，楊悠悠，等.中藥指紋圖譜研究的某些進展與展望[J].色譜，2008，26（2）：142-152.

[13] Indian Drug Manufacturers Association.Indian Herbal Pharmacopoeia[M].Vedams Books International，1998.

[14] 郭學敏，章玲，全山叢，等.皺皮木瓜中三萜化合物的分離鑒[J].中國中藥雜志，1998，23（9）：546-547.

[15] 田進國，許欣榮.紅外光譜法鑒別中藥材的初步探討[J].中草藥，1989，20（5）：29-32.

[16] 周玉新.中藥指紋圖譜研究技術[M].北京：化學工業出版社，2002：236.

[17] 梁逸曾.淺議中藥色譜指紋圖譜的意義、作用及可操作性[J].中藥新藥與臨床理，2001，12（3）：196-200.

[18] 徐瀾，安偉.紫外分光光度法同時測定色氨酸和酪氨酸[J].光譜實驗室， 2011，28（5）：2320-2323.

[19] 傅興圣，劉訓紅，林瑞超，等.磁石的傅里葉變換紅外光譜指紋圖譜研究[J].光譜學與光譜分析，2011，31（4）：947-950.

[20] 秦海林，趙天增.核磁共振氫譜鑒別植物中藥的研究[J].藥學學報，1999，34（1）：58-62.

[21] 孫慶雷，林云良，祝賀，等.核磁共振指紋圖譜控制中藥黃芪質量研究[C]//中國物理學會波譜專業委員會.第十五屆全國波譜學學術會議論文摘要集.武漢：中國物理學會波譜專業委員會，2008.

[22] AGINSKY V N.A new version of iniernal standard method in quantiativity thin-layer-chromatograthy[J].Joumey of planar chromatograthy，1994，7（4）：309-314.

[23] XIE P S，YAN Y Z.Differentiation & evaluation of commercial ginseng & their products by means of HPTLC fingerprint analysis [J].Journal of planar chromatography-modern TLC，1988，1（1）：29-32.

[24] 楊東風，梁宗鎖.中藥指紋圖譜研究進展[J].中國藥房，2007，18（6）：467-470.

[25] 丁平，余瓊希，梁英嬌，等.靈芝及其近緣種高效薄層色譜指紋圖譜的研究[J].中國藥學雜志，2009，44（24）：1855-1857.

[26] 蔡寶昌，潘楊，殷武.指紋圖譜在中藥研究中的應用[J].世界科學技術：中藥現代化，2000，2（5）：191-196.

[27] 謝彥，曾和平，李紅，等.色譜指紋圖譜在中藥質量控制中的應用研究[J].現代食品與藥品雜志，2007，17（l）：86-89.

[28] 徐青.中藥高效液相色譜分析方法發展的理論基礎研究[D].大連：中國科學院研究生院（大連化學物理研究所），2004.

[29] 王麗峰.高效液相色譜在中草藥質量控制中的應用[D].重慶：西南大學， 2009.

[30] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京：人民衛生出版社，2005：89-131.

[31] 馬金花，黎曉敏，徐愛平，等.重慶產杜仲葉HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2011，34（2）：206-208.

[32] 申福臣.中藥指紋圖譜技術及應用[J].河北化工，2007，30（8）：60-64.

[33] 田吉，馮文宇，邱華榮，等.金銀花藥材氣相指紋圖譜研究[J].瀘州醫學院學報，2002，25（1）：76-77.

[34] 康福忠，張立新，高木珍，等.中藥色譜指紋圖譜技術及應用前景[J].中國獸藥雜志，2005，39（9）：37-40.

[35] GU M，ZHANG S F，SU Z G，et al.Fingerprinting of Salvia miltiorrhiza Bunge by non-aqueous capillary electrophoresis compared with high-speed counter-current chromatography [J].Journal of chromatography A，2004，1057（1/2）：133-140.

[36] GU M，OUYANG F，SU Z G.Comparision of high-speed counter-current chromatography and high-performance liquid chromatography on fingerprint of Chinese traditional medicine[J].Journal of chromatography A，2004，1022（1/2）：139-144.

[37] 顧銘，張貴峰，蘇志國，等.高速逆流色譜技術在丹參指紋圖譜中的應用[J].中國藥品標準，2005，6（6）：7-12.

[38] 謝瑩，林梅，張正行，等.提高毛細管電泳重現性的幾種方法[J].藥學進展，1999，23（5）：261-264.

[39] 程偉，梅潔，肖玉秀.連錢草藥材的高效毛細管電泳指紋圖譜研究[J].氨基酸和生物資源，2006，28（2）：7-11.

[40] CAMPBELL T A.Molecular analysis of genetic variation among alfalfa（Medicago sativa L.）and Medicago ruthenica clones[J].Can J Plant Sci，2000，80（4）：773-779.

[41] VALIZADEH M，KANG K K，KANNO A，et al.Analysis of genetic distance among nine Medicago species by using DNA polymorphisms[J].Breeding seienee，1996，46（1）：7-10.

[42] CREGAN P B，JARVIK T，BUSH A L，et al.An integrated genetic linkage map of the soybean genome [J].Crop Sci，1990，39：1464-1490.

[43] 王志林，吳新榮，趙樹進.分子標記技術及其進展[J].生命化學，2001，21（1）：39-42.

[44] 李明軍，杜明鳳.淫羊藿植物的DNA指紋圖譜的構建[J].安徽農業科學，2011，39（18）：10820-10824.

[45] 喬善磊，朱臻宇，王建軍，等.中藥指紋圖譜相似度計算的規范化研究[J].第二軍醫大學學報，2004，25（10）：1114-1117.

[46] 楊忠民，李忠民，趙曰利，等.指紋圖譜相似度新算法的研究[J].中國測試技術，2008，34（3）：141-144.

[47] 王龍星，肖紅斌，梁鑫淼，等.一種評價中藥色譜指紋譜相似性的新方法：向量夾角法[J].藥學學報，2002，37（9）：713-717.

[48] 戴云，葉艷青，馮偉博，等.化學模式識別在中藥質量控制中的應用[J].云南民族大學學報（自然科學版），2007，16（4）：334-337.

[49] 蘇薇薇，吳忠.中藥指紋圖譜及計算機信息處理[J].世界科學技術：中藥現代化，2001，3（2）：165-168.

[50] 康福忠，張立新，高木珍，等.中藥色譜指紋圖譜技術及應用前景[J].中國獸藥雜志，2005，39（9）：37-40.

[51] 陳鷺穎，苑述剛.指紋圖譜在中藥及復方研究中的應用[J].海峽藥學，2003，15（2）：93-94.