山羊子宮內膜細胞的體外培養技術及其應用研究進展

張艷艷 匡世軍

摘要 對目前現有的山羊子宮內膜細胞的體外培養技術及其應用的研究進展進行了綜述，旨在為該技術在山羊上的進一步應用提供參考。

關鍵詞 山羊；子宮內膜細胞；體外培養；應用

中圖分類號 S827 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0102-02

Research Progress on the Culture Technologies of Endometrial Cells of Goat in vitro and Their Application

ZHANG Yan-yan1， KUANG Shi-jun2 （1.Department of Pharmaceutical Science and Technology，Heze University， Heze，Shandong 274015； 2. Chongqing Kaizhou Vocational Education Center， Chongqing 405400）

Abstract The research progress on current culture techniques of goat′s endometrial cells in vitro and their applications were reviewed，so as to provide references for further application of this technique in goat.

Key words Goat；Endometrial cells；Culture in vitro；Application

子宮是雌性動物孕育胎兒、繁殖后代的場所，受多種激素的調節，同時也是一個重要的內分泌器官，能分泌包括激素、酶類和免疫因子在內的多種功能性物質。這些物質不僅調節子宮本身的功能狀態和生殖平衡，在整個機體的生理協調方面也發揮著極其重要的作用[1]。子宮內膜位于子宮壁最里層的子宮腔面，由上皮層和其下的固有層構成；上皮層主要是由具有分泌功能的子宮內膜上皮細胞組成，而固有層則主要是由子宮內膜基質細胞組成；此外，子宮內膜還含有少量的表皮細胞、血管平滑肌細胞和炎性細胞等[2]。因此，子宮內膜細胞的培養就是對子宮內膜上皮細胞和基質細胞的培養。子宮內膜在研究機體生殖生理方面具有重要地位[3]。子宮內膜上皮細胞和基質細胞都是性腺激素的靶細胞，在雌孕激素的調節下發生一系列變化，為胚胎著床做準備。這種變化不僅包括細胞形態的改變，而且包括細胞增殖和分泌功能的變化，分泌的各種影響因子能促進胚胎著床和維持妊娠[4]。

在體狀態下研究子宮內膜容易受到機體其他因素的影響，而體外培養細胞不僅可以排除這些干擾，而且能直接對細胞進行觀察和處理。因此，體外培養的子宮內膜細胞成為研究子宮內膜細胞生長分化機制、雌孕激素對子宮內膜的作用機理以及母體子宮與胚胎之間的相互作用和應答反應的最佳材料。目前，子宮內膜細胞的分離培養已經在人[5]、小鼠[6]、兔[7]、奶牛[8]、牦牛[9]、綿羊[10]、豬[11]、山羊[12-13]等多種動物上獲得成功，其中人和小鼠的相關研究較多、較成熟，其體外細胞模型已被廣泛應用[14]。此外，還構建出永生化的人[15]、綿羊[16]和山羊[17]等子宮內膜細胞。近年來，山羊子宮內膜細胞的體外培養和相關應用不斷取得新成果，為研究山羊生殖生理、內分泌和免疫等提供了基本材料和理論基礎。筆者對目前現有的山羊子宮內膜細胞的體外培養技術及其應用的研究進展進行了綜述，旨在為該技術在山羊上的進一步應用提供參考。

1 山羊子宮內膜細胞的體外分離

體外細胞的原代培養主要有組織塊貼壁法和消化酶分散法等。其中，用消化酶分散成單細胞培養是最常用的方法，不僅操作簡單，能在短時間內獲得大量細胞，而且得到的細胞形態均一，成功率較高[18]。分離原代細胞常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶等。胰蛋白酶作用較強，消化速度雖快，但對細胞損害較大；膠原酶作用溫和，對細胞損傷小。靳亞平等[19]對2種消化酶消化分解小鼠和山羊子宮內膜組織效果的比較也證實，用膠原酶于37 ℃下消化 4 h，得到的細胞活率最高。

2 山羊子宮內膜上皮細胞與基質細胞的提取與純化子宮內膜中主要含有基質細胞和上皮細胞。目前，從子宮內膜組織消化液中分別提取基質細胞和上皮細胞的常用方法有篩網過濾法和自然沉降法。篩網過濾法是利用2種細胞的體積差異，將細胞混懸液過200目或400目濾網，使其分離。自然沉降法是利用2種細胞沉降速度的不同，將細胞混懸液靜置一段時間后，上皮細胞沉降到底部，而基質細胞仍在液體中，從而得以分離。

在山羊子宮內膜細胞的分離純化方面，豐艷妮[12]和吳慶俠等[13]研究表明這2種方法都不能得到高純度的山羊子宮內膜上皮和基質細胞。單純的濾網過濾，仍有大量上皮細胞留在濾液中，得到的上皮細胞較少，基質細胞中也混有較多的上皮細胞，純度低；自然沉降則因為消化液比較黏稠，耗時較長，此外沉淀中還混有未消化完全的組織塊。他們分別首次對山羊子宮內膜上皮細胞和基質細胞進行了分離培養，并取得了成功。結果發現，采用消化過濾-低速離心-自然沉淀相結合的方法能一次性分離到純度高于95%的山羊子宮內膜基質和上皮細胞。

2.1 消化過濾

將子宮內膜剪成1 mm3左右小塊，用D-Hanks液反復洗滌幾次，直至液體變得清亮，以除去雜質細胞。然后，再將洗凈的組織塊放入三角瓶中，加入適量膠原酶，37 ℃下消化4 h后，用適量含胎牛血清的DMEM/F12培養液混勻，終止消化。將消化后的懸濁液用200目篩網過濾，以去除未消化的組織塊，收集濾過液。

2.2 低速離心-自然沉淀

將過200目篩網的上述濾液，放入離心管中，低速離心，分別收集離心管內液體和管底沉淀，分別用于提取子宮內膜基質細胞和上皮細胞。

2.2.1 子宮內膜基質細胞的提純。取上述離心后的管內液體，移至新離心管內，低速離心，取管內細胞沉淀，用D-Hanks液重新混勻，靜置，待自然沉降一段時間后收集上部液體，再進行低速離心，棄去上層液體，將管底細胞沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸后接種培養。24 h后換液，得到純度較高的子宮內膜基質細胞。

2.2.2 子宮內膜上皮細胞的提純。取過濾網后首次離心的沉淀，加D-Hanks液重懸，低速離心后棄去上層液體，底部沉淀再用D-Hanks液混勻，靜置，使細胞自然沉降后，收集沉淀，再用D-Hanks液重懸、靜置、沉降。將最后得到的細胞沉淀加D-Hanks液重懸，離心，棄去上清，管底沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培養液混勻，接種培養2～3 d后換液，得到純度較高的子宮內膜上皮細胞。

3 子宮內膜細胞的鑒定

根據上皮細胞和基質細胞形態特征的差異，進行初步鑒定；此外，還需要通過免疫組化染色加以確定。

3.1 細胞形態鑒定

新分離的山羊子宮內膜基質細胞一般為單個分散存在，貼壁較快，一般接種30 min即可貼壁，10 h后就開始生長，3～4 d后鋪滿培養瓶底。基質細胞呈梭形，相互平行并排列成束狀，細胞胞質較稀薄而透明。

剛分離的山羊子宮內膜上皮細胞則呈細胞團塊狀存在，貼壁較慢，接種12 h后才開始貼壁，24 h后細胞團塊外側的細胞開始生長，7 d左右才能鋪滿瓶底。上皮細胞呈鋪路石狀，細胞間連接緊密，界限清晰，細胞質透明度小。上皮細胞生長緩慢，傳代較難，2～3代后細胞就會出現空泡化而逐漸脫落。

3.2 免疫組化染色鑒定

子宮內膜上皮細胞中含有角蛋白，不含波形蛋白；子宮內膜基質細胞則含有波形蛋白，不含角蛋白。因此，可分別用角蛋白和波形蛋白作為一抗，對上皮細胞和基質細胞進行免疫組化染色加以區分。上皮細胞的染色結果角蛋白呈陽性、波形蛋白呈陰性，基質細胞的染色結果則為角蛋白呈陰性、波形蛋白呈陽性。

4 體外培養山羊子宮內膜細胞的應用

豐艷妮[20]通過將山羊子宮內膜上皮細胞與豬外周血單核細胞共培養，用培養過山羊子宮內膜細胞上皮細胞的培養上清液作為條件培養液，對外周血單核細胞進行培養。結果發現，2種培養方式都能顯著刺激外周血單核細胞的增殖，并能抑制植物血球凝集素（PHA-P）對外周血單核細胞增殖的誘導作用。這表明子宮內膜上皮細胞可直接影響外周血單核細胞的活性，參與調節子宮免疫平衡。吳慶俠等[21]研究了山羊子宮內膜基質細胞培養上清液對山羊外周血單核細胞和外周血淋巴細胞轉化與分泌活性的影響，結果發現基質細胞培養上清液可刺激外周血單核細胞和外周血淋巴細胞的轉化以及IL-2、IL-4的分泌，并抑制PHA-P誘導的細胞增殖和IL-2分泌，但對PHA-P誘導的IL-4分泌具有促進或協同作用。這表明山羊子宮內膜基質細胞可能通過旁分泌途徑來影響外周血單核細胞和外周血淋巴細胞的轉化與分泌活性，從而調節子宮局部免疫調節。

由于體外培養的山羊子宮內膜細胞較難傳代，特別是上皮細胞，并且隨著培養時間的延長，細胞容易出現變異而失去利用價值，細胞數量也難以達到研究要求。因此，目前對山羊子宮內膜細胞的研究主要集中在永生化細胞系的建立和應用上。

吳慶俠等[22]和盛宏霞等[23]分別將人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因導入原代山羊子宮內膜上皮細胞和基質細胞中，獲得的陽性克隆細胞與原代細胞具有相同的形態特征與生物學特性，具有較高的端粒酶活性，并保持了對雌孕激素刺激的正常應答反應。永生化的細胞增殖能力增強，傳代穩定，可為構建子宮內膜體外模型、研究子宮局部免疫調節等提供大量的、表型一致、功能正常的試驗材料。南志春等[24]利用永生化的山羊子宮內膜細胞證實基質細胞對上皮細胞IL-18的分泌活性有調節作用。屈延延等[25]研究表明在性腺激素作用下永生化山羊子宮內膜基質細胞對上皮細胞的TNF-α與TGF-β分泌活性有重要影響。廖慶紅等[26]研究表明山羊子宮內膜細胞與性腺激素對子宮自然殺傷細胞（uNK）分泌血管內皮生長因子（VEGF）和γ-干擾素（IFN-γ）的活性有不同程度的調節作用。

此外，研究者還利用永生化的山羊子宮內膜細胞作為體外模型，對子宮內膜相關疾病進行了研究。白東寧等[27]以永生化山羊子宮內膜上皮細胞作為體外模型，觀察了乳酸菌和一些致病菌對子宮內膜上皮細胞的黏附特性，結果發現乳酸菌和致病菌對子宮內膜上皮細胞都有很強的黏附性，而乳酸菌對這些病原菌的黏附性有不同程度的拮抗作用，表明永生化山羊子宮內膜上皮細胞可作為研究細菌黏附性的切實有效的體外材料。鄺曉嬌等[28]利用永生化的山羊子宮內膜上皮細胞，建立子宮內膜上皮細胞炎癥模型，研究丹參水提物對山羊子宮內膜上皮細胞炎癥模型中基質金屬蛋白酶-2表達的影響，結果表明丹參水提物對內毒素引起的子宮內膜炎癥反應有一定的保護作用。

5 小結

綜上所述，目前已經在體外成功分離到山羊子宮內膜細胞，并構建了永生化的山羊子宮內膜細胞。利用永生化的山羊子宮內膜細胞，研究人員對山羊子宮內膜細胞的生殖生理功能和子宮內膜炎癥機制進行了深入探討。然而，目前對山羊子宮內膜細胞的研究仍不夠廣泛和深入。今后對山羊子宮內膜細胞的研究可利用永生化的山羊子宮內膜細胞對子宮內膜的生殖生理變化、藥物篩選和子宮內膜炎癥機制等方面進行進一步探討，從而為山羊子宮內膜相關疾病的研究提供基礎。

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