抗1型血小板反應蛋白7A抗體與特發性膜性腎病的關系

夏虹+張久丹+呂杭麗+陳紅波+何靈芝+張培培

[摘要] 目的 探討抗1型血小板反應蛋白7A（Thrombospondin type 1 domain-containing 7A，THSD7A）抗體對特發性膜性腎病的診斷和疾病活動監測價值。 方法 本研究收集了經腎活檢并確診的IMN 127例，并以同期50例非IMN腎臟疾病為對照，采用半定量WB檢測被試者血清中抗THSD7A抗體，采用定量ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）檢測被試者血清中抗THSD7A抗體滴度。回顧性分析臨床資料。 結果 利用WB方法，血清中抗THSD7A抗體在IMN中陽性率為7.1%；利用ELISA方法，血清中抗THSD7A抗體在IMN中陽性率為7.9%；抗體滴度水平越高，則低白蛋白血癥越嚴重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05）；eGFR下降越明顯（P<0.05）。WB和ELISA兩種方法的抗體檢出率比較差異無統計學意義（P=0.5）。 結論 IMN中抗THSD7A抗體的檢出率不高，該抗體對IMN診斷具有較高的特異性，診斷準確性良好。抗THSD7A抗體可反映IMN的活動性。

[關鍵詞] 膜性腎病；抗1型血小板反應蛋白7A抗體；酶聯免疫吸附測定

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the value of thrombospondin type 1 domain-containing 7A（THSD7A ） antibody in the diagnosis and disease activity monitoring of idiopathic membranous nephropathy（IMN）. Methods In this study， 127 cases of IMN diagnosed by renal biopsy were collected and 50 cases of non-IMN kidney disease in the same period were as control group. Semi-quantitative Western blot was used to detect anti-THSD7A antibody in serum. Quantitative ELISA（Enzyme-linked immuno sorbent assay） was used to detect anti-THSD7A antibody titers in the subjects' serum. The clinical data were retrospectively analyzed. Results The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.1% by WB method. The positive rate of anti-THSD7A antibody in IMN was 7.9% by ELISA. The higher the antibody titer level， the more severe the low albuminemia（P<0.05）， the larger the 24-hour urine protein quantitative value （P<0.05）， and the more obvious the eGFR（P<0.05）. There was no significant difference in antibody detection rate between WB and ELISA（P=0.5）. Conclusion The detection rate of anti-THSD7A antibody in IMN is not high. The antibody has high specificity for IMN diagnosis and good diagnostic accuracy. Anti-THSD7A antibodies can reflect the activity of IMN.

[Key words] Membranous nephropathy； Thrombospondin type 1 domain-containing 7A； Enzyme-linked immunosorbent assay

膜性腎病（Membranous nephmpathy，MN）是導致成人腎病綜合征最常見的疾病之一，其發生率逐年遞增[1]；其中特發性膜性腎病（Idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一組病因不明的MN的總稱，長期以來被認為是一種自身免疫病，但致病抗原和抗體一直沒有得到明確。Beck等[2]在2009年發現血清中存在針對人類足細胞上磷脂酶A2受體（Phospholipase A2 receptor，PLA2R）的自身抗體，并指出該抗體可能是IMN的病因[3]，其在IMN的特異性很高[4，5]，總敏感性為52%～78%[6，7]。同時研究者們也發現，一部分IMN患者的血清中抗PLA2R抗體是陰性的，一部分繼發性膜性腎病患者的血清中抗PLA2R抗體是陽性的[8]，說明還可能存在其他導致IMN的自身抗原和抗體。2014年，Tomas等[9]發現又一新的足細胞抗原，即THSD7A，其在IMN患者中陽性率約為2.5%～5%，最近的一次大樣本檢測顯示其陽性率為2.6%[10]，在PLA2R非相關IMN的波士頓隊列研究中陽性率高達8.18%[11]。本研究對成年IMN患者和同期非IMN患者血清中抗THSD7A抗體進行了檢測，探討該抗體對IMN的診斷和病情活動監測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 IMN組 收集2010年1月～2016年1月在我院行腎活檢并確診的IMN患者127例。納入標準：病理符合膜性腎病，腎活檢時留存血清標本，臨床資料完整。排除標準：病理表現不典型，或者有明確及可疑繼發因素。

1.1.2 非IMN組 隨機選取同期其他經腎活檢確診的腎臟病理類型患者50例，男23例，女27例，平均年齡（40.2±15.6）歲。其中繼發性膜性腎病7例，狼瘡性腎炎15例，微小病變型腎病2例，新月體腎炎3例，IgA腎病23例。本研究獲得我院倫理審查委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料收集 包括基本信息、詳細病史及治療情況、實驗室檢查結果等。實驗室檢查結果包括尿指標（24 h尿蛋白定量）和血指標（血尿、血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白、自身抗體、補體、免疫球蛋白、腫瘤指標）等。

1.2.2 GFR估計值（eGFR） 采用慢性腎臟病流行病學合作研究（CKD-EPI）公式計算，具體為：（1）男性：①若血肌酐≤0.9 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.9）-0.411×0.993年齡；②若血肌酐>0.9 mg/dL，則采用公式GFR=141×（血肌酐/0.9）-1.209×0.993年齡；（2）女性：①若血肌酐≤0.7 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-0.329×0.993年齡；②若血肌酐>0.7 mg/dL，則采用公式GFR=144×（血肌酐/0.7）-1.209×0.993年齡。上述公式中的血肌酐單位均為mg/dL。

1.2.3 血清標本收集 腎活檢同一時期留存所有研究對象的血清標本，所有標本放置-80°冰箱保存備用。

1.2.4 抗THSD7A抗體檢測 （1）采用ELISA對所有血清標本進行抗體滴度檢測（美國Antibodies公司，貨號ABIN2539542），操作按說明書進行，抗THSD7A抗體滴度<3 pg/mL判定為陰性（為該試劑所能檢測到最低下限）。（2）采用WB對所有血清標本進行抗體檢測（Abcam公司貨號ab121122），血清樣品加上上樣緩沖液，混勻，100°C煮5 min，將制備的血清蛋白樣品80V電泳30 min后，改用120V電泳120 min，再將分離膠上的蛋白轉至硝酸纖維素膜上，再分別孵育一抗、二抗，洗滌后用增強的化學發光液顯色，在凝膠圖像分析系統照相掃描蛋白條帶的吸光帶。

1.3 統計學分析

利用統計學軟件SPSS 20.0進行統計學處理。計量資料采用（x±s）表示，相應的組間比較采用t檢驗或方差分析；非正態、方差不齊資料的組間比較采用非參數秩和檢驗。對于計數資料以百分比或頻數表示，組間比較采用χ2檢驗。IMN診斷準確性分析以腎活檢病理為金標準繪制ROC曲線。ELISA和WB兩種方法對抗體檢出率差異比較采用Mcnemar檢驗，ELISA和WB兩種方法對抗體檢出率一致性比較采用Kappa檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

見表1。IMN組和非IMN組患者臨床資料以及WB、ELISA兩種方法檢測的兩組患者中抗THSD7A抗體的陽性率。

2.2 IMN組患者不同臨床情況抗THSD7A抗體陽性率

見表2。根據年齡范圍、性別、血白蛋白、24 h尿蛋白定量、病理分期以及免疫抑制劑的使用情況分別分組，統計出不同項目分組中抗THSD7A抗體的陽性例數及百分比。

2.3 不同抗THSD7A抗體滴度的IMN患者白蛋白、24 h尿蛋白定量以及eGFR情況

見表3。抗體滴度水平越高，則低白蛋白血癥越嚴重（P<0.05），24 h尿蛋白定量值越大（P<0.05），eGFR下降越明顯（P<0.05）。

2.4 抗THSD7A抗體對IMN診斷的準確性

以腎活檢病理結果為金標準，利用ELISA檢測比較抗THSD7A抗體對IMN診斷的準確性（圖1）。抗THSD7A抗體診斷IMN的敏感性為7.9%，特異性為98%。Youden指數為0.059。抗THSD7A抗體診斷IMN的AUCROC為0.529，95%CI 0.437～0.622。

2.5 WB和ELISA對抗THSD7A抗體檢出率的差異性、一致性比較

見表4。兩種方法抗體檢出率比較差異無統計學意義（P=0.5），兩種方法抗體檢出率有較好一致性（Kappa=0.894，P<0.001）。

3 討論

本研究中，我們利用WB和ELISA兩種方法來檢測不同類型腎臟病患者血清中抗THSD7A抗體，其檢出率分別為7.1%和 7.9%，WB方法檢出的抗體陽性患者均來自于IMN患者，ELISA方法檢出的抗體陽性患者有且僅有1例來自于非IMN患者。我們進一步分析抗THSD7A抗體陽性的IMN患者，其白蛋白水平、24 h尿蛋白定量以及eGFR值隨抗體滴度升高的變化情況，我們發現抗體滴度水平越高，低白蛋白血癥越嚴重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明顯，且3個抗體滴度兩兩比較，上述三項指標差異均具有統計學意義。本研究對WB和定量ELISA進行了檢出率差異性和一致性的比較，結果顯示，兩者對抗體的檢出率無差異，一致性良好。

Tomas[9]和Larsen等[12]所報道的歐美IMN患者的抗THSD7A抗體陽性率為2.5%～5%，Iwakura等[13， 14]報道，日本IMN患者中抗THSD7A抗體陽性率為9.1%，本研究中我們得到的結果是7.9%，在文獻報道的范圍之內。在2016年的另一篇文章里，同樣是在日本IMN患者中，Norifumi等[15]的研究得到抗THSD7A抗體陽性率為3.4%，與Iwakura等[14]的研究結果相比明顯偏低，推測可能與檢測方法、樣本量、患者血清采集時間等不同有關。

閱讀相關其他文獻，并結合我們自身的研究結果，發現IMN患者中抗THSD7A抗體總體檢出率不高，不同的研究中，涉及到的檢測方法不同，主要包括WB、免疫熒光和免疫組化，得到的結果均在10%以內。分析檢出率低的原因可能為：①存在導致IMN的其他種類足細胞自身抗原抗體系統，這一點已得到證實，據報道約75%的IMN患者的血清中抗磷脂酶A2受體（PLA2R）抗體是陽性的[16]，可能還有醛糖還原酶、超氧化物氣化酶、α-烯醇酶等[17-19]；②病情緩解：如果抗體檢測前患者已接受免疫抑制劑治療或自發緩解，此時抗體可能已經轉陰；③樣本量不足；④實驗條件不足；⑤潛在繼發因素未發現，即雖被診斷為IMN，實際上仍存在未被發現的潛在激發因素。

本研究中選取50例非IMN患者作為對照，WB檢測所有上述患者的抗THSD7A抗體均為陰性，我們發現該抗體的特異性為100%，與文獻報道基本一致[9]。因此，抗THSD7A抗體可作為IMN與非IMN的鑒別診斷標志物。不過該抗體在鑒別IMN和繼發性MN是也存在一些未解決的難點，如本研究中有1例繼發性MN患者的抗THSD7A抗體（ELISA方法檢出）是陽性，排除實驗誤差可能，結合其臨床資料，仍不能判斷該患者膜性腎病類型。文獻也有類似報道，Hoxha等[20]報道了一例抗THSD7A抗體相關的腫瘤患者，抗體陽性且腎組織、腫瘤組織、淋巴結的THSD7A抗原異常高表達。臨床中我們會遇到部分膜性腎病合并惡性腫瘤、HBV等可疑繼發因素，臨床傾向于繼發性MN，但無法除外IMN。一種觀點認為兩者是無關聯的并存疾病；一種觀點則認為兩者雖無直接因果關系，但也不是完全無關，感染、腫瘤、自身免疫病可引起機體內環境改變，足細胞受內環境影響可出現THSD7A抗原表達異常，同時機體免疫出現紊亂產生針對該抗原的自身抗體，從而導致膜性腎病發生；這些觀點均有待進一步研究去驗證。

本研究發現，抗體滴度水平越高者，低白蛋白血癥越嚴重，24 h尿蛋白定量值越大，eGFR下降越明顯。Tomas等[9]也有類似發現，進一步提示抗THSD7A抗體可反映IMN的活動性。

目前國內外抗THSD7A抗體檢測尚無統一、標準的方法，文獻報道的有WB、免疫組化、免疫熒光等。WB操作復雜，成本高，不太適合臨床推廣使用。ELISA可操作性相對較強，同時可觀察滴度的變化，臨床實用性更大。本研究對WB和ELISA進行了比較，結果顯示兩者對抗體的檢出率無差異，一致性良好，綜合分析ELISA更適合臨床推廣運用。

本研究仍存在以下不足，納入研究病例數較少，地域單一，研究結論上不能代表絕大多數患者情況。本研究尚沒有進行長期隨訪，不能明確抗體與預后轉歸的關系，更深一步的研究有待開展。

總之，本研究證實了IMN患者中抗THSD7A抗體明確存在，該抗體對IMN診斷具有較高的特異性，可反映IMN的活動性，作為IMN又一新的分子標記物，為IMN靶向治療提供了理論支持和新的研究方向。

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