致病性副溶血性弧菌特異性三重 PCR檢測(cè)方法研究

金雷 陳瑜 張小軍 施慧

摘要[目的]建立同時(shí)檢測(cè)致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速檢測(cè)方法。[方法] 用3種基因的特異性引物分別對(duì)副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA進(jìn)行單一擴(kuò)增，找到各自引物最佳擴(kuò)增條件；再用3種引物同步對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)優(yōu)化引物濃度、引物間比例以及退火溫度，建立最佳擴(kuò)增體系。[結(jié)果] 在最佳三重PCR反應(yīng)條件下，gyrase、tdh和toxR能同時(shí)擴(kuò)增出清晰條帶，大小分別為91、269和368 bp。[結(jié)論]該研究為致病性副溶血性弧菌的快速檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞致病性副溶血性弧菌；三重PCR；gyrase基因；tdh基因；toxR基因

中圖分類號(hào)TS207文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0132-02

Abstract[Objective] To establish a rapid specific triplexPCR method of pathogenic Vibrio parahaemolyticus by detecting gyrase， tdh and toxR genes simultaneously. [Method] The genomic DNA of V. parahaemolyticus ATCC33847 was amplified by three pairs of specific primers individually， the optimum amplification condition for each pair of primers was determined. Through optimizing the concentration and ratio of primers and anneal temperature， a triplexPCR method which can simultaneously amplify three target genes was established. [Result] The bands exhibiting the sequences of 91， 269 and 368 bp were amplified by gyrase，tdh，toxR respectively in an optimum triplexPCR reaction. [Conclusion] The triplexPCR method provides a new technical mean for the rapid detection of pathogenic V. parahaemolyticus.

Key wordsPathogenic Vibrio parahaemolyticus；TriplexPCR；gyrase gene；tdh gene；toxR gene

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種腸道致病性嗜鹽菌，廣泛存在于魚(yú)、蝦、蟹和貝類等海產(chǎn)品中[1-2]。人若誤食被副溶血性弧菌污染的海產(chǎn)品，可出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、腸痙攣、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重會(huì)發(fā)生休克[3]。在我國(guó)沿海省份夏秋季節(jié)，由副溶血性弧菌引起的食物中毒，已高居細(xì)菌性食物中毒首位[4]。據(jù)報(bào)道，自然環(huán)境中分離的副溶血性弧菌有95%是非致病性的，只有5%是致病性的[5-6]。因此，探索研究致病性副溶血性弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

傳統(tǒng)的致病性副溶血性弧菌檢測(cè)方法包括分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)[7-9]，整個(gè)過(guò)程存在工作量大、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高等問(wèn)題。而分子檢測(cè)技術(shù)因反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被越來(lái)越多地應(yīng)用。近年來(lái)，以檢測(cè)副溶血性弧菌特異性靶基因?yàn)槟繕?biāo)的分子檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展。黃晨陽(yáng)等[10]建立了基于toxR基因的PCR檢測(cè)副溶血性弧菌的方法；岳友宏等[11]開(kāi)發(fā)了同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌tlh和tdh基因的雙重PCR檢測(cè)方法；陳麗萍等[12]建立了同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速檢測(cè)方法。

toxR（跨膜轉(zhuǎn)錄激活蛋白）基因是近年來(lái)在副溶血性弧菌中發(fā)現(xiàn)的新的致病基因，其參與毒力基因的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)，與副溶血性弧菌的致病性和毒力密切相關(guān)[10]。tdh（熱穩(wěn)定性直接溶血素）基因編碼的耐熱直接溶血毒素，具有直接溶血活性，可以引起紅細(xì)胞溶血，毒力較強(qiáng)[13]。該研究以副溶血性弧菌toxR、tdh和保守基因gyrase為靶基因，通過(guò)優(yōu)化3種靶基因的引物濃度、引物間比例以及退火溫度，建立在1個(gè)反應(yīng)管中同步擴(kuò)增gyrase、tdh、toxR 3種目標(biāo)基因的三重PCR檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1供試菌株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33847，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.2主要儀器和試劑2720 Thermal Cycler PCR儀、BIO-RAD Sub-Cell GT 型電泳儀、HIR AYAMA HVE-50高壓蒸汽滅菌器、BSC-1000ⅡA2生物安全柜、Gel DocTM XR 170-8170凝膠成像分析系統(tǒng)、Eppendorf Centrifuge 5424高速離心機(jī)、HS-800D恒溫水浴鍋等。

Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000、10×PCR Buffer、細(xì)菌基因組DNA提純?cè)噭┖校?gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3引物以副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR為靶基因，利用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物[14-16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列見(jiàn)表1。

1.4副溶血性弧菌DNA模板的制備取純培養(yǎng)菌株接種于3% NaCl堿性蛋白胨水，（37±1）℃培養(yǎng)18 h。吸取表層菌液1 mL放入1.5 mL無(wú)菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄上清，無(wú)菌雙蒸水清洗2次，棄上清，然后用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒提取副溶血性弧菌的基因組DNA。

1.5單一及三重PCR反應(yīng)體系的建立用gyrase、tdh、toxR這3種基因設(shè)計(jì)的特異性引物分別對(duì)副溶血性弧菌ATCC 33847標(biāo)準(zhǔn)菌株的模板DNA進(jìn)行單一擴(kuò)增；再用上述3種引物同步對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR各循環(huán)參數(shù)和各試劑濃度等進(jìn)行優(yōu)化，篩選出三重PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。

2結(jié)果與分析

2.1單重PCR擴(kuò)增條件的確定以副溶血性弧菌ATCC 33847標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，分別用gyrase、tdh、toxR這3種基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，確定了各自PCR的最佳反應(yīng)條件。

副溶血性弧菌gyrase靶基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。25.00 μL反應(yīng)體系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。

副溶血性弧菌tdh靶基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。2500 μL反應(yīng)體系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。

副溶血性弧菌toxR靶基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。2500 μL反應(yīng)體系：ddH2O 17.75 μL，引物各0.25 μL，模板DNA 2.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.00 μL，Taq酶0.25 μL。

gyrase、tdh和toxR 均擴(kuò)增出清晰條帶，大小分別與預(yù)期的91、269、368 bp 結(jié)果相符（圖1）。

2.2三重 PCR 反應(yīng)條件的確定在單重PCR研究的基礎(chǔ)上，對(duì)三重PCR反應(yīng)體系條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。最佳反應(yīng)體系（25.00 μL）：模板DNA 2.00 μL，10 μmol/L gyrase基因的上下游引物各0.25 μL，10 μmol/L tdh基因的上下游引物各0.50 μL，10 μmol/L toxR基因的上下游引物各0.75 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，dNTP 2.50 μL，Taq酶0.50 μL，補(bǔ)充ddH2O至25.00 μL。

在最佳反應(yīng)條件下，三重PCR擴(kuò)增的目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

3結(jié)論

該試驗(yàn)以副溶血性弧菌的保守基因gyrase與特異性致病基因tdh、toxR為靶基因，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，分別進(jìn)行3種基因單一及三重PCR檢測(cè)，結(jié)果以gyrase、tdh、toxR基因?yàn)閱我话谢蚍謩e可以擴(kuò)增出91、269、368 bp條帶；同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化3種靶基因的引物濃度、引物間比例以及退火溫度，建立了在1個(gè)反應(yīng)管中同步擴(kuò)增3種目標(biāo)基因的三重PCR檢測(cè)方法。該研究建立的三重PCR檢測(cè)方法可用于快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的致病性副溶血性弧菌，對(duì)提高應(yīng)對(duì)因副溶血性弧菌污染而引起的食品安全事故的響應(yīng)速度，加強(qiáng)水產(chǎn)品副溶血性弧菌污染狀況應(yīng)急監(jiān)測(cè)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 石椿麗.從進(jìn)境的海產(chǎn)品中檢出副溶血性弧菌[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（3）：4-5.

[2] 何玉芳，裘偉康，郭智成，等.杭州市不同樣品中副溶血性弧菌污染狀況檢測(cè)[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2007，23（6）：745-746.

[3] YAMAZAKI W，ISHIBASHI M，KAWAHARA R，et al.Development of a loopmediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus[J].BMC Microbiology，2008，8（1）：163.

[4] 李曉虹，閆東麗.利用多重PCR檢測(cè)食品中副溶血性弧菌的方法研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（11）：1975-1977.

[5] JONES J L，VICKERY M C，BLACKSTONE G M，et al.Development of a multiplex realtime PCR assay with an internal amplication control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oystera[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（18）：5840-5847.

[6] CAI T X，JIANG L Y，YANG C B，et al.Application of realtime PCR for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood in eastern China[J].FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，46（2）：180-186.

[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品微生物學(xué)檢測(cè) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)：GB/T 4789.7—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[8] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).飼料中副溶血性弧菌的檢測(cè)：GB/T 26426—2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[9] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.進(jìn)出口食品中副溶血性弧菌檢測(cè)方法：SN/T 0173—2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[10] 黃晨陽(yáng)，于龍，蘭智杰，等.基于toxR基因的PCR檢測(cè)副溶血性弧菌的方法建立[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，24（5）：327-330.

[11] 岳友宏，蘇良.雙重PCR檢測(cè)副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立與初步應(yīng)用[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19（9）：1413-1415.

[12] 陳麗萍，劉忠民，陳蕓，等.特異性三重PCR快速檢測(cè)副溶血性弧菌[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（4）：764-775.

[13] 黃曉蓉，呂海滄，鄭晶，等.副溶血弧菌的多重PCR檢測(cè)[J].食品科學(xué)，2006，27（10）：445-446.

[14] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.進(jìn)出口食品中副溶血性弧菌快速及鑒定檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR方法：SN/T 2424—2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[15] FDA.Bacteriological analytical manual online chapter 9[S].Seventh Edition.American：Food and Drug Administration，2004.

[16] KIM Y B，OKUDA J，MATSUMOTO C，et al.Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J].Journal of clinical microbiology，1999，37（4）：1173-1177.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（14）：141-143，170