比色法測定泰樂菌素發酵液油含量的研究

高宏偉 蘭秀娟 牛春

摘要[目的]探討一種泰樂菌素發酵液油含量測定方法。[方法]利用比色法測定泰樂菌素發酵液中的油含量。[結果]該法在油含量為0.6～6.6 g/L時呈良好的線性關系（R2=0.999 8），平均回收率為106.7%，相對標準偏差為1.02%。[結論]該法精密度好、準確性高，可用于泰樂菌素發酵液油含量的測定。

關鍵詞泰樂菌素；比色法；油含量

中圖分類號TQ92文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0006-02

Abstract[Objective] The aim was to explore a colorimetric method for determination of tylosin oil content. [Method] We determined tylosin fermentation broth oil content by colorimetric method. [Result] The method had a good linear relationship（R2=0.999 8） when the oil content was 0.6-6.6 g/L； the average recovery was 106.7%； and the relative standard deviation was 1.02%. [Conclusion] The improved colorimetric method has good precision and high accuracy， so it can be used for determination of tylosin fermentation broth oil content.

Key wordsTylosin；Colorimetric method；Oil content

泰樂菌素的發酵以油為主要碳源，在發酵過程中主要以補油來滿足菌體對碳源的需求，油中的油酸、亞油酸經甲基化形成甲基油酸，它是泰樂菌素生物合成的前體物質，發酵液中油含量的高低對菌體的呼吸代謝和產物的合成有重要影響，含量低，不利于產物的合成，含量高，菌體不能完全利用，產生脂肪酸積累，pH下降，影響代謝[1]。因此，必須嚴格控制發酵液中的油含量。目前，泰樂菌素發酵中主要通過乙醚提取法測定發酵液中脂肪含量的方法控制油含量，該法測定結果受人為因素的影響大，測定結果不準確，不能很好地指導補油，另外，乙醚極易揮發、易燃易爆、毒性大，對人體有麻醉作用，污染環境[2]。

比色法是一種能夠快速測定游離脂肪酸含量的有效方法，曾兆國等[3]利用該法測定莫能菌素發酵液中油含量，取得了很好的效果。劉永樂等[4]用分光光度法測定發酵液中液體脂肪的含量，其結果準確，操作簡便、快速。筆者對該法進行了一定的改進，并測定了泰樂菌素發酵液中的油含量，旨在為泰樂菌素發酵液中油含量的嚴格控制提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑。油酸、異辛烷、吡啶、醋酸銅、氫氧化鉀、無水乙醇、鹽酸均為分析純，油（發酵用）。

1.1.2主要儀器。TE612-L電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；MTV-100多管漩渦混合儀，上海之信儀器有限公司；TD25B低速自動平衡離心機，上海盧湘儀離心機有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司；UV1800紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2方法

1.2.1試劑的配制。

1.2.1.10.25 mol/L乙醇制KOH溶液的制備。取14.0 g 氫氧化鉀置于燒杯中，加適量無水乙醇溶解并定容至1 000 mL。

1.2.1.25.0%醋酸銅溶液的制備。取5.0 g醋酸銅，用純化水溶解，過濾，并定容至100 mL，搖勻后，用吡啶調節pH為6.1～6.4。

1.2.1.33.0 mol/L鹽酸溶液的制備。在1 000 mL燒杯中加入752 mL蒸餾水，再緩慢加入248 mL鹽酸，攪拌，冷卻。

1.2.1.41.5%油酸基準液的配制。稱取1.5 g油酸于100 mL容量瓶中，用異辛烷溶解并定容，搖勻。

1.2.2脂肪酸測定流程。試樣乙醇KOH溶液水解→定容無水乙醇離心HCl還原醋酸銅顯色→測定。

1.2.3油酸基準液吸收曲線的測定。取11.0 mL 1.5%油酸基準液于25 mL 容量瓶中，用異辛烷定容，搖勻。吸取5.0 mL于25 mL比色管中，加入1.0 mL醋酸銅溶液，旋渦振蕩90 s后，靜置20 s，以異辛烷為空白，在650～750 nm波長內每隔10 nm測量1次，在最大吸收處每隔5 nm測1次，以波長λ為橫坐標，OD值為縱坐標繪制吸收曲線。

1.2.4油酸基準液標準曲線的測定。分別取1.5%油酸基準液1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00 mL置于25 mL 容量瓶中，用異辛烷定容，搖勻，得到0.60、1.80、3.00、4.20、5.40、6.60 g/L系列濃度油酸溶液。每種濃度的溶液各吸取5.00 mL于25 mL比色管中，加入1.00 mL醋酸銅溶液，旋渦振蕩90 s，靜置20 s，以異辛烷為空白，測定有機系OD值，以OD值為橫坐標，油酸基準液濃度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5發酵液油含量測定。稱取1.5～2.5 g發酵液于25 mL比色管中，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液搖勻，于60～80 ℃水浴中水解20 min（每隔5 min振蕩1 min），水解完全，冷卻后，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻后3 000 r/min離心10 min，取用無水乙醇適當稀釋后的上清液5.0 mL于25 mL比色管中，加3 mol/L鹽酸溶液10.0 mL，搖勻，再加異辛烷5.0 mL，充分振蕩提取5 min，靜置1 min，取上層有機溶液2.0 mL于10 mL比色管中，加3.0 mL異辛烷，混勻后加1.0 mL醋酸銅顯色劑，振蕩90 s，靜置20 s，用異辛烷做空白測定有機系OD值，以標準曲線回歸方程油含量。

油含量（g/100 g）=（5.396 6A+0.004 3）×稀釋倍數1V×A

式中，V為吸取萃取上清液體積（mL）；A為稱取發酵液的質量（g）。

1.2.6水解時間的測定。稱取0.30 g油加水至2.00 g，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液，于70 ℃水解5、10、15、20、25、30 min，按“1.2.4”的方法進行測定，以水解時間為橫坐標，OD值為縱坐標作圖。

2結果與分析

2.1油酸基準液吸收曲線由圖1可知，當波長λ為700 nm時，達到最大吸收。因此，可確定最大吸收波長為700 nm。

2.2油酸基準液標準曲線由圖2可知，回歸方程為y=5.396 6x+0.004 3，相關系數R2=0.999 8。結果表明，油含量在0.6～6.6 g/L時有良好的線性關系。

2.3水解時間由圖3可知，當水解時間達20 min時，吸光值達到最大且基本不變。

2.4精密度對同一樣品按“1.2.5”的方法測定5個平行樣。結果表明，該方法有較高的精密度和重復性，相對標準偏差（RSD）為1.02%。

2.5加樣回收率分別稱取發酵液1.5～2.5 g于6支25 mL比色管中，在其中的5支比色管中加入0.1 g油，按“1.2.5”的方法進行測定，計算回收率。計算公式：加樣回收率=（A-B）/C×100%，其中A為加油樣油含量（mg/g）；B為發酵液油含量（mg/g）；C為加油量/發酵液重量（mg/g）。由表1可知，該方法有較高的回收率，平均加樣回收率為106.7%。

3結論

采用分光光度法測定發酵液中的殘油含量具有以下特點：①試驗所需檢測設備簡單。②靈敏度高，可檢測0.6～6.6 g/L的油含量。③精密度好，準確度高，樣品回收率高。④分析速度快，能夠及時、快速、準確地反映出發酵液中的油含量，為泰樂菌素發酵過程中油的控制提供參數，一般可在1.5 h內完成。因此，該測定方法可用于泰樂菌素發酵生產過程中油含量的測定[5-6]。

參考文獻

[1] 甘士喜，廖錦秀，張立紅，等.泰樂菌素組份轉化機制的研究[J].中國獸藥雜志，2000，34（4）：22-24.

[2] 張琪，華惠敏，劉永衡，等.有機氮源對泰樂菌素發酵生產影響的研究[J].糧食與飼料工業，2013，12（11）：43-46.

[3] 曾兆國，李成梅，胡秀珍.分光光度法測定莫能菌素發酵液中油含量[J].養殖與飼料，2008（4）：105-106.

[4] 劉永樂，焦娜，黃壽恩，等.用分光光度法測定發酵液中液體脂肪的含量[J].食品工業科技，2004，25（5）：127-128.

[5] 余雯靜.食品中脂肪含量的分析[J].蘇州大學學報（工科版），2002，22（5）：95-98.

[6] 俞一夫.國內外糧食、油料脂肪測定方法評析[J].西部糧油科技，2000，25（1）：46-48.