三重qPCR法快速檢測肺炎克雷伯菌的方法建立與應用

鄒享珍，蔡淑英，劉妙娥，林丹麗，桑 慧

(東莞樟木頭醫院 檢驗科，廣東 東莞523633)

三重qPCR法快速檢測肺炎克雷伯菌的方法建立與應用

鄒享珍，蔡淑英，劉妙娥，林丹麗，桑 慧

(東莞樟木頭醫院 檢驗科，廣東 東莞523633)

目的 建立三重qPCR法(實時熒光定量)快速檢測肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，期以快速精準診斷呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染，為早期精準治療提供依據。方法 根據GenBank公布的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因序列選擇保守區設計測序引物，高保真擴增東莞樟木頭醫院分離到的95株肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA 基因，經測序比對后，避開變異區和突變點分別設計檢測引物和探針，建立三重qPCR方法直接檢測臨床呼吸道樣本，并與培養及測序法比較，驗證其診斷靈敏度和特異性等性能指標。結果 三重qPCR法檢測肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，其檢測下限低至2 cfu/PCR，檢測靈敏度98.9%(94/95),檢測特異性97.9%(93/95)；診斷靈敏度98.6%(424/430)，診斷特異性98.8%(2295/2324)；從樣品處理到報告結果≤1.2 h。結論 該方法簡便、快速、靈敏度高、特異性好，可實現呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染的快速與精準診斷，為早期精準治療贏得時間。

肺炎克雷伯氏菌；精準診斷；qPCR；rcsA基因；23s RNA基因

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的病原菌之一，可引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡，其臨床癥狀與其他細菌感染并無兩樣，臨床難以針對該菌精準治療。近年來，由于無法早期精準治療，其耐藥問題日益突出，嚴重影響了治療效果[1，2]。培養法是目前常用的檢測方法，也是金標準，一般需要2-3天，甚至更久，其時效性、簡便性、靈敏度等均無法滿足臨床快速精準診斷的需求[3]。實時熒光定量PCR(qPCR)以其快速、簡便、靈敏度高、特異性強等優點，在病原微生物基因快速檢測方面迅速發展，已成為金標準方法的重要補充[4-6]，比如，國內已公布兩項專利應用于肺炎克雷伯菌的輔助診斷[7，8]。但筆者發現，兩項專利技術只檢測單基因，且均未對我國流行分布的肺炎克雷伯菌相關基因進行測序比對，僅根據NCBI或文獻資料來設計引物和探針，由于生物進化、地區分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強的致命缺點。在精準醫學日益發展的當下，現有發明已無法滿足需求，發明新的能實現精準診斷并適合我國人群的方法迫在眉前。由此，筆者基于Taqman 熒光探針技術，同時檢測肺炎克雷伯菌rcsA和23s RNA兩個持家基因，在進一步提高檢測和診斷靈敏度、特異性方面取得了較好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 留取2015年1月 -2016年12月期間來東莞樟木頭醫院就診的呼吸道感染患者下呼吸道樣本2754例，其中，男性1051例，女性1703例，年齡0.7-85歲。

1.1.2 儀器與試劑 ①細菌培養基產自江門凱林公司，類型：血平板、麥康凱平板和普通營養瓊脂；細菌鑒定藥敏分析儀產自英國SENSITITRE公司，型號：AutoReader；細菌鑒定卡為原配細菌鑒定卡。②核酸提取儀產自深圳市匯研科創公司，型號：ExPure-20；提取試劑為配套的磁珠法呼吸道樣本核酸提取及細菌培養物核酸提取試劑盒。③熒光定量PCR儀產自Roche公司，型號：LightCycler480及上海宏石公司出產的SLAN-965；多重熒光定量PCR 體系(5*qPCR MIX)購自上海靈鈺生物技術公司；高保真體系(Super-Fidelity DNA Polymerase)購自Vazyme公司；EvaGreen熒光染料購自美國Biotium公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和選取 痰液樣本采用吸痰或深咳法留取于無菌痰培養瓶內，經涂片革蘭氏染色鏡檢，白細胞 >25個/HP ，鱗狀上皮細胞<10個/HP判為合格，否則棄用；肺泡灌冼液直接注入無菌痰培養瓶內。

1.2.2 細菌培養與鑒定 將合格的痰液或肺泡灌冼液接種于血平板和康凱平板，置35℃ CO2孵箱培養24-48小時，挑取可疑菌落，進行革蘭氏染色、氧化酶和觸酶試驗，根據實驗結果選擇相應的細菌鑒定卡上機鑒定。所有操作按儀器和試劑SOP 文件進行。

1.2.3 核酸提取與純化 ① 痰液細菌基因組核酸提取：在痰液收集瓶中約加入等體積痰液液化劑(含N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化劑0.25%，滅菌劑0.2%，EDTA 10 mmol/L)，漩渦振蕩5 min，吸取液化痰液100 μl 至上述磁珠法呼吸道樣本核酸提取試劑條第一孔，上機提取細菌基因組核酸。② 肺泡灌冼液細菌基因組核酸提取：直接取細胞灌冼液100 μl同痰液細菌基因組核酸提取方法上機提取。③ 細菌培養物基因組核酸提取：挑取純培養菌落用生理鹽水調成0.5 Mcf 菌懸液，吸菌懸液100 μl至上述磁珠法細菌培養物核酸提取試劑條第一孔，上機提取細菌基因組核酸。所有操作按儀器和試劑SOP 文件進行，提取純化后的核酸吸入無酶EP管凍存于-86℃冰箱備用。

1.2.4 質控/內標質粒構建 用DNAMN 軟件生成一段1 000 bp 隨機DNA序列，其中A、T、C、G 四種堿基各占25%，委托TaKaRa大連寶生物公司構建和提取質粒。

1.2.5 測序引物設計與合成 從GenBank數據庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因序列各50條，用DNAMN比對軟件分別進行比對，避開變異區或突變點后，用Primer 5 設計rcsA、23S rRNA基因及質控/內標質粒測序引物各3對，委托TaKaRa大連寶生物公司合成。

1.2.6 高保真體系、擴增參數優化 ①rcsA和23S rRNA基因測序引物篩選與擴增參數優化：挑取對數生長期的肺炎克雷伯氏菌純培養菌落用生理鹽水調成約2.0*108cfu/ml，經平板菌落計數法確定濃度后稀釋至1.0*108cfu/ml，10倍連續稀釋成8個梯度濃度菌懸液，提取純化核酸后，在高保真PCR體系中加入推薦濃度的引物、模板和EvaGreen熒光染料，用三步擴增加溶點曲線方法在不同退火溫度條件下擴增梯度濃度模板，分別從3對測序引物中選一對擴增效率、線性范圍與關系、非特異擴增、熒光值增幅及擴增曲線形狀最均衡的引物作為最終測序引物，以該引物的最佳擴增參數作為最終的擴增參數。② 質控/內標質粒測序引物篩選與擴增參數優化：根據質粒濃度用計算法將質粒稀釋至1.0*108Copies/ml ，再10倍連續稀釋成8個梯度濃度，同方法①一樣選出一對最好的引物并確定擴增參數。

1.2.7 高保真PCR產物測序與質控 用優化后的高保真體系和溫度參數擴增95株臨床分離的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因，同時擴增質控/內標質粒，高保真PCR產物委托廣東騰飛基因公司測序，質控/內標質粒測序結果與設計序列100%符合方接受臨床分離株測序結果。

1.2.8 三重qPCR引物、探針設計與合成標記 根據測序分析比對結果，避開變異區或突變點后，用Beacon Designer 7 設計肺炎克雷伯菌rcsA和23S rRNA基因及質控/內標質粒檢測引物和探針各3組，委托TaKaRa大連寶生物公司合成及標記。

1.2.9 三重qPCR體系、擴增參數優化 采用交叉組合方式，在多重熒光定量PCR 體系中加入推薦濃度的引物、探針、和上述1.2.6的梯度濃度模板及適量質控/內標，用兩步法在不同退火溫度條件下擴增，分別從9組檢驗引物、探針中選一組擴增效率、線性范圍與關系、非特異擴增、熒光值增幅及擴增曲線形狀最均衡的作為最終檢測體系，以該體系的最佳擴增參數作為最終的擴增參數。

1.2.10 三重qPCR結果判斷標準 rcsA和23S rRNA兩基因及質控/內標擴增曲線均呈“S”形，CT值均≤36，擴增曲線與基線夾角均≥30°判為陽性，否則判為陰性。1.2.11 三重qPCR檢測下限試驗與判斷 用優化的三重qPCR檢測體系和參數擴增1.2.6的梯度濃度模板，以能判陽的最低加入模板數作為檢測下限。

1.2.12 三重qPCR檢測靈敏度試驗與計算 用優化的三重qPCR檢測體系和參數擴增95株肺炎克雷伯菌，計算檢測靈敏度。檢測靈敏度=陽性數÷95*100%。

1.2.13 三重qPCR檢測特異性試驗 用優化的三重qPCR檢測體系和參數擴增95株非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常見感染菌(包括：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、β溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質沙雷菌各10株及卡他莫拉菌5株)，計算檢測特異性。檢測特異性=陰性數÷95*100%。

1.2.14 三重qPCR真陽性、真陰性判斷與驗證 真陽性：①培養鑒定為肺炎克雷伯菌；②培養法陰性，但qPCR法陽性，經高保真擴增測序與肺炎克雷伯菌ATCC 700603標株兩基因的相同片段同源性≥90%。真陰性：①培養及qPCR兩種檢測方法均為陰性；② qPCR檢測陽性，但經高保真擴增測序與標株相同片段同源性<90%。

1.2.15 三重qPCR診斷靈敏度、特異性試驗與計算 將合格的臨床呼吸道樣本用三重qPCR進行檢測，結果與培養法不一致時，按1.2.14方式處理和判斷。診斷靈敏度=真陽性數÷(真陽性數+假陰性數)*100%；診斷特異性=真陰性數÷(真陰性數+假陽性數)*100%。

2 結果

2.1 細菌培養與鑒定結果 2015年1月-2016年12月期間，共收到合格呼吸道樣本2754份，分離出355株肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等其他細菌881株。

2.2 測序引物篩選結果 9對測序引物經篩選后，綜合性能最好的3對引物序列見表1。

2.3 高保真體系優化結果 高保真PCR反應體系為25.0 μl，包括2*Buffer 12.5 μl、dNTP MIX(10 mM each)0.5 μl、10 μM引物各0.5 μl、53倍高保真熱啟動DNA聚合酶(1 U/μl)0.5 μl、50*EvaGreen 0.5 μl、模板5.0 μl，加無菌雙蒸水至終體積25.0 μl。PCR擴增參數為：95℃ 2 min+(95℃ 10 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s)*30，選擇FAM通道于延伸階段探測熒光。用該體系擴增肺炎克雷伯菌模板，擴增曲線呈“S”形，與基線夾角≥45°；水空白曲線與基線平行，無非特異擴增現象，擴增曲線見圖1。

2.4 三重qPCR引物、探針物篩選結果 9組檢測引物、探針經篩選后，綜合性能最好的3組引物、探針序列見表2。

表2 rcsA和23S rRNA基因及質控/內標三重qPCR引物、探針表

2.5 三重qPCR體系、擴增參數優化結果 三重qPCR反應體系為40.0 μL，包括5*qPCR MIX 8.0 μl、10 μM引物各1.2 μL、10 μM探針各0.4 μL、50 Copies/ul質控/內標0.1 μL，模板20.0 μL，加無菌雙蒸水至終體積40.0 μL。qPCR擴增參數為：95℃ 2分鐘+(95℃ 10秒，60℃ 40秒)*40，選擇FAM、VIC和ROX 三通道于退火階段探測熒光。用該體系擴增48份呼吸道樣本模板，擴增曲線呈“S”形，與基線夾角≥45°；水空白曲線與基線平行，無起跳。FAM通道擴增曲線見圖2。

2.6 三重qPCR檢測下限試驗結果 三重qPCR檢測體系擴增肺炎克雷伯菌梯度濃度模板，擴增曲線呈“S”形，各梯度間隔均勻，最低檢測濃度為102cfu/ml，對應的最低檢測限為2 cfu/PCR，水空白曲線與基線平行，無起跳。FAM通道擴增曲線見圖3。

圖3 三重qPCR擴增肺炎克雷伯梯度模板熒光曲線圖

2.7 三重qPCR檢測靈敏度及特異性試驗結果 三重qPCR檢測體系擴增95株肺炎克雷伯菌，94株陽性，檢驗靈敏度98.9%(94/95)；擴增95株非肺炎克雷伯菌模板，2株陽性，檢驗特異性97.9%(93/95)。

2.8 三重qPCR診斷靈敏度及特異性試驗結果 三重qPCR檢測體系擴增2754份呼吸道樣本模板，從培養肺炎克雷伯菌陽性的355份樣本中，檢出349份陽性，6份陰性；從未培養出肺炎克雷伯菌的2399份樣本中，檢出104份陽性，這 104份樣本經高保真擴增測序后比對后，有75份為肺炎克雷伯菌，29份為非肺炎克雷伯菌。經計算，三重qPCR診斷靈敏度為98.6%(424/430)，特異性為98.8%(2295/2324)。

3 討論

近年來，隨著抗生素、免疫抑制劑、激素的大量使用，肺炎克雷伯菌感染呈上升趨勢，除可引起下呼吸道感染外，還可引發菌血癥、膿毒癥、肝膿腫及泌尿系感染[9]。目前，肺炎克雷伯菌的檢測以痰培養技術為金標準，該方法檢測周期長，操作繁瑣。二十世紀末，Higuchi等[10]人發明了實時熒光Taqman探針定量PCR技術，將PCR擴增和產物的檢測結合一起進行定量分析。而三重qPCR檢測方法的原理，是在實時熒光Taqman探針定量的基礎上，采用多孔板，利用熒光染料和探針，同時檢測多個樣品或者基因，針對不同基因設計具有相同或接近的退火溫度和延伸時間的引物和探針的分析技術。因反應體積少，還大大的節省試劑和時間，具有靈敏度高、特異性強、重復性好、自動化程度高、檢測快速等特點，所以比細菌培養方法靈敏快速。

隨著分子生物學技術的飛速發展，實時熒光Taqman探針技術也只應用于肺炎克雷伯菌的RNA基因的單個檢測，均未對我國流行分布的肺炎克雷伯菌相關基因進行測序比對，僅根據NCBI或文獻資料來設計引物和探針，由于生物進化、地區分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強的致命缺點。本文選取肺炎克雷伯菌的rcsA和23s RNA兩個持家基因來設計引物和探針，在實時熒光Taqman探針技術的基礎上，經測序比對后，避開變異區和突變點分別設計檢測引物和探針，建立三重qPCR方法直接檢測臨床呼吸道樣本，周時檢測多個樣品和基因。并與培養及測序法比較，驗證其診斷靈敏度和特異性等性能指標。研究表明，三重qPCR檢測體系經優化后檢測靈敏度及特異性高為98.9%、97.9%；診斷靈敏度及特異性高為98.6%、98.8%。具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強、批量檢測等優點，并在從樣品處理到報告結果≤1.2 h極短時間內做出快速診斷，為臨床醫生的抗生素治療方案提供快速有效的科學依據，完全可用于下呼吸道感染的初步篩選和指導臨床抗生素的合理使用，有效預防多重耐藥菌的產生和傳播。同時為本實驗室將建立一種同時檢測多個細菌實施三重熒光定量 PCR方法，形成一套多通道快速檢測兒童重癥呼吸道感染病原體的方法提供了參考。

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東莞市樟木頭科技項目(2015105101232)

1007-4287(2017)06-0993-05

R378

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2017-01-24)