嬰幼兒肝炎綜合征患者代謝因子臨床意義研究

李 嫻，宋銀森，趙 鼎，李林飛，張振華，陳重芬，郭振欣

(鄭州市兒童醫院,河南 鄭州450000)

嬰幼兒肝炎綜合征患者代謝因子臨床意義研究

李 嫻，宋銀森，趙 鼎，李林飛，張振華，陳重芬，郭振欣*

(鄭州市兒童醫院,河南 鄭州450000)

目的 探討嬰幼兒肝炎綜合征(IHS)患兒干血片氨基酸和肉堿濃度變化的臨床意義。方法 應用HPLC/MS/MS測定患兒組與對照組干血片氨基酸及肉堿濃度。結果 患兒組與對照組相比辛酰基肉堿C8、葵酰基肉堿C10濃度降低，十四烷酰基肉堿C14、十六烷酰基肉堿C16濃度升高(P<0.05)；纈氨酸(VAL)濃度降低，瓜氨酸(CIT)濃度升高(P<0.05)。結論 嬰幼兒肝炎綜合征患兒血中氨基酸及肉堿濃度的變化對其診斷和治療具有一定的臨床意義。

氨基酸;肉堿;嬰兒肝炎綜合征;串聯質譜法

(ChinJLabDiagn,2017,21:0990)

嬰幼兒肝炎綜合征簡稱嬰肝征(IHS)，它不是一種獨立的疾病，而是指一組1歲以內(包括新生兒期)起病，伴有血清膽紅素升高，肝臟腫大和肝功能損害的臨床癥候群。它是嬰幼兒期常見的黃疸性疾病之一，以肝內病變為主，病因復雜、預后懸殊。為探討遺傳代謝病篩查在嬰幼兒肝炎綜合征診治中的價值，我們應用HPLCC/MS/MS技術對100例嬰幼兒肝炎綜合征患兒及同期在我院體檢的100例健康兒童測定其干血片中氨基酸和肉堿的濃度，其結果如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年10月-2014年11月我院消化內科住院治療的嬰幼兒肝炎綜合征患兒共100例，其中年齡最小為1個月，最大為2歲，男57例，女43例，診斷標準參考全國嬰幼兒肝炎綜合征診斷標準[1]。對照組為同期在我院健康體檢的兒童100例，男60例，女40例，年齡6個月-3歲。兩組在年齡、性別分布上無顯著差異(P>0.05)。

1.2 標本采集方法 使用一次性采血針刺足跟或手指，深度小于3 mm，將血滴于Scheicher and Schuell 903濾紙樣本卡，血斑正反面一致，室溫下自然晾干呈深褐色，放于封口塑料袋內，保存于2-8℃冰箱中待檢。

1.3 儀器及試劑 甲醇、乙腈、甲酸胺、甲酸均為高效液相色譜級別，購自Sigma公司。96孔聚丙烯錐形板，96孔過濾板，同位素內標及質控購自PerkinElmer公司。氨基酸內標11種：2H4-丙氨酸，2H4，13C-精氨酸，2H2-瓜氨酸，15N，2-13C-甘氨酸，2H3-亮氨酸，2H3-蛋氨酸，2H6-鳥氨酸，13C6-苯丙氨酸，13C5-脯氨酸，13C6-酪氨酸，2H8-纈氨酸。酰基肉堿內標13種：2H9-游離肉堿，2H3-乙酰肉堿，2H3-丙酰肉堿，2H3-丁酰肉堿，2H9-異戊酰肉堿，2H6-戊二酰肉堿，2H3-己酰肉堿，2H3-辛酰肉堿，2H3-癸酰肉堿，2H3-十二酰肉堿，2H3-十四酰肉堿，2H3-十六酰肉堿，2H3-十八酰肉堿。上述內標在實驗前用甲醇稀釋成工作液備用。儀器:美國安捷侖公司高效液相色譜儀(Agilent 1600) 及6460Triple Quad MS/MS型串聯質譜儀。

1.4 測定方法 用打孔器將濾紙片打出直徑3 mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，每次實驗加入高低兩個質控及一個空白，每孔加入工作液100 μl，以封板膜密封，放置于恒溫震蕩儀以700轉/分震蕩45 min，然后提取75 μl上清液加入另一個96孔聚丙烯錐形板中，鋁箔包裹，即上樣檢測。高效液相色譜儀的流動相采用乙腈和純水，自動進樣器每次進樣2 μl，每次測定采用多反應監測方式進行檢測。一個樣品測試約需7 min。

1.5 數據分析 質譜數據的定量分析采用安捷倫公司的自帶軟件Mass Hunter B.05.00 根據各種氨基酸、肉堿及其同位素內標的離子峰強度計算出樣品中氨基酸及肉堿濃度，采用spss 17.0軟件進行數據分析，測定結果以均數±標準差表示。IHS組患兒與正常組的比較采用t檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

IHS組與對照組相比，辛酰基肉堿C8、葵酰基肉堿C10濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)；十四烷酰基肉堿C14、十六烷酰基肉堿C16濃度升高，差異有統計學意義(P<0.05)，其它肉堿與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。HIS組與對照組比較，纈氨酸(VAL)濃度降低，差異有統計學意義；瓜氨酸(CIT)濃度升高，差異有統計學意義，其它氨基酸與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，表2。

表1 嬰肝組與對照組血片的肉堿濃度比較

3 討論

采用質譜技術進行新生兒及嬰幼兒的遺傳代謝病篩查已經廣泛應用于美國、歐洲等發達國家[2,3]。嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內存在代謝紊亂，董梅[4]對遺傳代謝病類嬰幼兒肝炎綜合征進行分類，分為四類，分別是膽汁酸代謝障礙，糖代謝障礙，氨基酸代謝障礙及脂類代謝障礙。我們使用HPLC/MS/MS對100例嬰幼兒肝炎綜合征患兒進行遺傳代謝病篩查發現部分氨基酸及肉堿濃度發生改變，如：辛酰基肉堿C8、葵酰基肉堿C10、十四烷酰基肉堿C14、十六烷酰基肉堿C16、纈氨酸、瓜氨酸。說明這些物質可能與嬰幼兒肝炎綜合征有密切關系。患兒血片中辛酰基肉堿C8、葵酰基肉堿C10濃度升高提示可能患有中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)。而我們的研究發現嬰幼兒肝炎綜合征患兒血片中辛酰基肉堿C8及葵酰基肉堿C10濃度明顯降低，提示嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內存在脂肪酸代謝障礙，與中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)能明顯區分開來。患兒血片中十四烷酰基肉堿C14及十六烷酰基肉堿C16濃度升高提示可能存在極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(VLCAD),我們的研究發現嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內C14及C16濃度較對照組升高，但在正常參考范圍上限以內；嬰幼兒肝炎綜合征與VLCAD不容易區分，因此實踐中我們要結合基因診斷、酶學分析及脂肪酸氧化流量分析等綜合考慮[5,6]。

表2 嬰肝組與對照組血片的氨基酸濃度比較

嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內也存在氨基酸代謝紊亂。瓜氨酸是尿素循環中的中間代謝產物，當尿素循環受阻時就會導致瓜氨酸在體內貯積、血氨升高，嬰幼兒肝炎綜合征常伴有肝功能損害，我們推測可能是這個原因引起瓜氨酸濃度升高、血氨升高。纈氨酸是人體八種必需氨基酸之一，它與亮氨酸及異亮氨酸一起工作，促進身體正常生長，它還幫助從肝臟清除多余的氮，并將身體需要的氮運輸到各個部位，當嬰肝癥發生時，纈氨酸與對照組相比濃度降低，差異有統計學意義。而亮氨酸雖然濃度也降低，但是與對照組相比，差異無統計學意義。因此對嬰幼兒肝炎綜合征來說，纈氨酸可能更敏感一些，作為一個輔助指標，指導臨床治療。

嬰幼兒肝炎綜合征病因很多，常見以感染為主，病毒感染是其主要病因，大約占50%[7]。嬰幼兒肝炎綜合征并發癥多，預后各不相同，因此需要聯合檢測生化、B超等多種指標以明確病因對癥治療[8,9]，降低患兒死亡率。

[1]朱啟镕，王曉紅，王建設.嬰兒肝病綜合征診治修訂方案[J].中華傳染病雜志，2004，22(5)：357.

[2]Therrell BL,Adams J.New born screening in North American[J].J Inherit Metab Dis,2007,30(4):447.

[3]Loeber JG.Neonatal screening in Europe:the situation in2004[J].J Inherit Metab Dis,2007,30(4)：430.

[4]董 梅.遺傳代謝病類嬰兒肝炎綜合征[J].實用兒科臨床雜志，2011，26(7)：469.

[5]Liebig M,Schymik I,Mueller M,et al.Neonatal screening for very long-chain acyl-coA dehydrogenase deficiency:enzymatic and molecular evaluation of neonates with elevated C14:1-carnitine levels[J].Pediatrics,2006,118(3):1065.

[6]Wanders RJ,Vreken P,den Boer ME,et al.Disorders of mitochondrial fatty acyl-CoA beta-oxidation[J].J Inherit Metab Dis,1999,22(4):442.

[7]宋文琪，張美和,等.血清總膽汁酸測定在嬰兒肝炎綜合征中的應用[J].中華檢驗醫學雜志，2001，24：227.

[8]丁 艷，熊 昊，黃志華,等.嬰兒肝炎綜合征血清和膽汁成分變化的臨床意義[J].實用兒科臨床雜志，2007，22(7)：506.

[9]卜勁松.生化指標變化對嬰兒炎肝綜合征的臨床診斷價值[J].中國婦幼保健，2012，33：5434.

The Clinical Significance of metabolic factor in infant hepatitis syndrome

LIXian,SONGYin-sen,ZHAODing,etal.

(ZhengzhouChildren'sHospital，Zhengzhou450000,China)

Objective The clinical significance of amino acid and carnitine with dried blood concentration in children of infantile hepatitis syndrome (IHS).Methods HPLC/MS/MS was used to examine the dried blood samples of infantile hepatitis syndrome (IHS) with the control group and the patient group of amino acid and carnitine concentration. Results Compared with control group,octanoylcarnitine C8,decanoylcarnitine C10 concentration is reduced,while tetradecyl acyl carnitine C14,palmitoylcarnitine C16 concentration increases(P< 0.05); Valine (VAL) concentration is reduced,citrulline (CIT) concentration increases(P<0.05) .Conclusion Changes in amino acid and carnitine concentrations in blood of children with hepatitis syndrome in infants conclusion has some clinical significance in the diagnosis and treatment.

Amino acid；Carnitine；Infant hepatitis syndrome；Tandem mass spectrometry

河南省醫學科技攻關計劃指導性計劃項目，編號201304082

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0990-03

R725

A

李嫻，女，34歲，碩士，主管檢驗技師，研究方向：小兒遺傳及代謝病。

2016-11-12)