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高溫漆酶的克隆表達及其性能的研究

2017-06-29 15:34:50俞青霞呂斌葛玨希
東方教育 2017年8期

俞青霞+呂斌+葛玨希

摘要:漆酶(laccase),是一種典型的綠色催化劑,應用范圍廣泛。目前工業化的漆酶商品主要來源真菌發酵,但在高溫、高鹽或強堿性等極端環境中,真菌漆酶易失活,限制了其應用范圍。相比之下,細菌漆酶具有耐高溫、耐高堿性的優勢,且發酵生產周期短,具有廣闊的推廣前景。現歸納近年來關于產漆酶菌株的分離、漆酶的克隆表達等研究成果,對高溫漆酶的克隆表達和性能研究對于拓展漆酶的范圍、深入地進行高溫漆酶的理論研究,指出高溫漆酶良好的開發前景,以此來擴大漆酶的應用范圍。

關鍵詞:高溫漆酶;克隆表達;性能

漆酶(Laccase, p-diphenoldioxygen:oxidoreductase, EC 1.10.3. 2),即p-對苯二酚:雙氧氧化還原酶,是一種多酚類氧化還原蛋白,屬于藍多銅氧化酶家族(bluemulticopperoxid- oreductase, BMCOs)[1]。漆酶具有特殊的催化性能和非常寬泛的底物專一性,能夠利用多種酚類化合物及其衍生物、芳香胺及其衍生物等為氫供體,以O2為電子受體,催化底物氧化使之生成相應的苯配和水,是一種環境友好的綠色催化劑[2]。

漆酶的底物非常廣泛,主要是酚類化合物、芳胺類、芳香梭酸類、甾體激素及生物色素、金屬有機化合物等[3, 4]。因此,漆酶可以用來處理木質素、酚類污染物、農藥、除草劑等,在環境保護、造紙工業、食品工業等領域具有很大的研究和應用價值,另外,利用漆酶進行藥物的修飾加工、功能高分子材料的合成也是近年來研究的熱點之一[5],熱穩定性較好的漆酶因在污水處理、功能高分子的合成等領域具有獨特的應用價值而倍受關注[6, 7]。

1.獲取耐高溫漆酶的基因片段

提取嗜熱芽孢桿菌DNA;設計引物,獲得僅表達高溫漆酶的基因片段,并用PCR技術進行擴增;將基因片段連接到載體上,并轉入表達型大腸桿菌細胞(BL21);測序,驗證所獲片段是否為耐高溫片段;分離純化BL21表達的蛋白,該蛋白即為高溫漆酶。

2.高溫漆酶的耐受溫度范圍及最適反應溫度

高溫漆酶最適反應溫度為60℃,該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性。但因為溫度梯度以10℃為間隔,根據曲線趨勢觀察,最適反應溫度也有可能介于50℃-60℃之間。

3.高溫漆酶的耐受pH范圍

經測量可知,高溫漆酶在4-11pH值的條件下酶活大小有較大變化,在4.0、5.0、9.0、10.0和11.0的條件下,高溫漆酶的酶活幾乎接近于0%,而在pH值為7.0時相對酶活達到最大。可知高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0,最適pH反應條件為7.0。

4.抑制劑、有機溶劑對高溫漆酶的活性影響

4.1抑制劑對高溫漆酶的活性影響

抑制劑對酶活的影響如表1所示。三種抑制劑中DDT對高溫漆酶的一直效果最顯著,DDT濃度為0.1mmol/L時就可以使得酶活性降低90%以上;EDTA對高溫漆酶具有一定程度的抑制作用,但抑制作用不是非常明顯,在濃度為100mmol/L時,殘余酶活性仍舊能夠達到50%以上;SDS對高溫漆酶不僅沒有較強的抑制作用,反而對酶活有一定的促進作用,當SDS濃度為10mmol/L時,酶活性仍有升高現象。

4.2有機溶劑對高溫漆酶的活性影響

根據測量可知,高溫漆酶的活性隨著有機溶劑濃度的升高而降低。三種有機溶劑中,丙酮和乙醇對高溫漆酶活性的影響比甲醇要大,當乙醇和丙酮的濃度達到20%時,高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。

5.結論

通過研究發現,高溫漆酶最適反應溫度為60℃,該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性;高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0,最適pH反應條件為7.0;DDT對高溫漆酶的一直效果最顯著,DDT濃度為0.1mmol/L時就可以使得酶活性降低90%以上;EDTA對高溫漆酶具有一定程度的抑制作用,但抑制作用不是非常明顯,在濃度為100mmol/L時,殘余酶活性仍舊能夠達到50%以上;SDS對高溫漆酶不僅沒有較強的抑制作用,反而對酶活有一定的促進作用,當SDS濃度為10mmol/L時,酶活性仍有升高現象。

高溫漆酶的活性隨著有機溶劑濃度的升高而降低。三種有機溶劑中,丙酮和乙醇對高溫漆酶活性的影響比甲醇要大,當乙醇和丙酮的濃度達到20%時,高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。此高溫漆酶對結晶紫和靚紅有很強的脫色效果,此高漆酶酶的酶學性質表明此酶具有一定的工業化應用價值。

參考文獻:

[1]Galhaup C, Goller S, Peterbauer CK, Strauss J, Haltrich D. Characterization of the major laccaseisoenzyme from Trametespubescens and regulation of its synthesis by metal ionsa[J]. Microbiology. 2002,148(7): 2159-2169.

[2]陶亮亮. 重組里氏木霉產耐髙溫漆酶的研究 [D]. 杭州: 浙江大學. 2014.

[3]Baldrian P. Fungal laccases–occurrence and properties [J]. FEMS microbiology reviews. 2006,30(2):215-242.

[4]宋安東, 王艷婕, 王松江, 戚元成, 吳坤. 漆酶的分子生物學研究及其應用[J]. 信陽師范學院學報: 自然科學版. 2004,17(2):244-248.

[5]Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry[J]. TRENDS in Biotechnology. 2006,24(5):219-226.

[6]Chairattanamanokorn P, Imai T, Kondo R, Ukita M, Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters[J]. Applied biochemistry and biotechnology. 2006,128(3):195-204.

[7]Kiiskinen LL, R?tt? M, Kruus K. Screening for novel laccase‐producing microbes[J]. Journal of applied microbiology. 2004,97(3):640-646.

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