高溫漆酶的克隆表達及其性能的研究

俞青霞+呂斌+葛玨希

摘要：漆酶（laccase），是一種典型的綠色催化劑，應用范圍廣泛。目前工業化的漆酶商品主要來源真菌發酵，但在高溫、高鹽或強堿性等極端環境中，真菌漆酶易失活，限制了其應用范圍。相比之下，細菌漆酶具有耐高溫、耐高堿性的優勢，且發酵生產周期短，具有廣闊的推廣前景。現歸納近年來關于產漆酶菌株的分離、漆酶的克隆表達等研究成果，對高溫漆酶的克隆表達和性能研究對于拓展漆酶的范圍、深入地進行高溫漆酶的理論研究，指出高溫漆酶良好的開發前景，以此來擴大漆酶的應用范圍。

關鍵詞：高溫漆酶；克隆表達；性能

漆酶（Laccase， p-diphenoldioxygen：oxidoreductase， EC 1.10.3. 2），即p-對苯二酚：雙氧氧化還原酶，是一種多酚類氧化還原蛋白，屬于藍多銅氧化酶家族（bluemulticopperoxid- oreductase， BMCOs）[1]。漆酶具有特殊的催化性能和非常寬泛的底物專一性，能夠利用多種酚類化合物及其衍生物、芳香胺及其衍生物等為氫供體，以O2為電子受體，催化底物氧化使之生成相應的苯配和水，是一種環境友好的綠色催化劑[2]。

漆酶的底物非常廣泛，主要是酚類化合物、芳胺類、芳香梭酸類、甾體激素及生物色素、金屬有機化合物等[3， 4]。因此，漆酶可以用來處理木質素、酚類污染物、農藥、除草劑等，在環境保護、造紙工業、食品工業等領域具有很大的研究和應用價值，另外，利用漆酶進行藥物的修飾加工、功能高分子材料的合成也是近年來研究的熱點之一[5]，熱穩定性較好的漆酶因在污水處理、功能高分子的合成等領域具有獨特的應用價值而倍受關注[6， 7]。

1.獲取耐高溫漆酶的基因片段

提取嗜熱芽孢桿菌DNA；設計引物，獲得僅表達高溫漆酶的基因片段，并用PCR技術進行擴增；將基因片段連接到載體上，并轉入表達型大腸桿菌細胞（BL21）；測序，驗證所獲片段是否為耐高溫片段；分離純化BL21表達的蛋白，該蛋白即為高溫漆酶。

2.高溫漆酶的耐受溫度范圍及最適反應溫度

高溫漆酶最適反應溫度為60℃，該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性。但因為溫度梯度以10℃為間隔，根據曲線趨勢觀察，最適反應溫度也有可能介于50℃-60℃之間。

3.高溫漆酶的耐受pH范圍

經測量可知，高溫漆酶在4-11pH值的條件下酶活大小有較大變化，在4.0、5.0、9.0、10.0和11.0的條件下，高溫漆酶的酶活幾乎接近于0%，而在pH值為7.0時相對酶活達到最大。可知高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0，最適pH反應條件為7.0。

4.抑制劑、有機溶劑對高溫漆酶的活性影響

4.1抑制劑對高溫漆酶的活性影響

抑制劑對酶活的影響如表1所示。三種抑制劑中DDT對高溫漆酶的一直效果最顯著，DDT濃度為0.1mmol/L時就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA對高溫漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明顯，在濃度為100mmol/L時，殘余酶活性仍舊能夠達到50%以上；SDS對高溫漆酶不僅沒有較強的抑制作用，反而對酶活有一定的促進作用，當SDS濃度為10mmol/L時，酶活性仍有升高現象。

4.2有機溶劑對高溫漆酶的活性影響

根據測量可知，高溫漆酶的活性隨著有機溶劑濃度的升高而降低。三種有機溶劑中，丙酮和乙醇對高溫漆酶活性的影響比甲醇要大，當乙醇和丙酮的濃度達到20%時，高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。

5.結論

通過研究發現，高溫漆酶最適反應溫度為60℃，該高溫漆酶在20℃-90℃均具備活性；高溫漆酶的pH耐受范圍為5.0-9.0，最適pH反應條件為7.0；DDT對高溫漆酶的一直效果最顯著，DDT濃度為0.1mmol/L時就可以使得酶活性降低90%以上；EDTA對高溫漆酶具有一定程度的抑制作用，但抑制作用不是非常明顯，在濃度為100mmol/L時，殘余酶活性仍舊能夠達到50%以上；SDS對高溫漆酶不僅沒有較強的抑制作用，反而對酶活有一定的促進作用，當SDS濃度為10mmol/L時，酶活性仍有升高現象。

高溫漆酶的活性隨著有機溶劑濃度的升高而降低。三種有機溶劑中，丙酮和乙醇對高溫漆酶活性的影響比甲醇要大，當乙醇和丙酮的濃度達到20%時，高溫漆酶的殘余酶活就下降到了50%以下。此高溫漆酶對結晶紫和靚紅有很強的脫色效果，此高漆酶酶的酶學性質表明此酶具有一定的工業化應用價值。

參考文獻：

[1]Galhaup C， Goller S， Peterbauer CK， Strauss J， Haltrich D. Characterization of the major laccaseisoenzyme from Trametespubescens and regulation of its synthesis by metal ionsa[J]. Microbiology. 2002，148（7）： 2159-2169.

[2]陶亮亮. 重組里氏木霉產耐髙溫漆酶的研究 [D]. 杭州： 浙江大學. 2014.

[3]Baldrian P. Fungal laccases–occurrence and properties [J]. FEMS microbiology reviews. 2006，30（2）：215-242.

[4]宋安東， 王艷婕， 王松江， 戚元成， 吳坤. 漆酶的分子生物學研究及其應用[J]. 信陽師范學院學報： 自然科學版. 2004，17（2）：244-248.

[5]Riva S. Laccases： blue enzymes for green chemistry[J]. TRENDS in Biotechnology. 2006，24（5）：219-226.

[6]Chairattanamanokorn P， Imai T， Kondo R， Ukita M， Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters[J]. Applied biochemistry and biotechnology. 2006，128（3）：195-204.

[7]Kiiskinen LL， R?tt? M， Kruus K. Screening for novel laccase‐producing microbes[J]. Journal of applied microbiology. 2004，97（3）：640-646.