MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測中的應用

郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強元

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測中的應用

郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強元

目的 通過對180株金黃色葡萄球菌臨床分離株MecA、Nuc基因的檢測，以期選擇出一種適合臨床的并能簡便、快速、準確檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的方法。方法 細菌鑒定及藥敏采用全自動細菌鑒定和藥敏分析儀。MecA、Nuc基因檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法。結果 FQ-PCR對180株金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因檢出率為75.0%，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為72.8%，2種檢測方法比較差異無統計學意義(P＞0.05)。全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對MRSA的檢測正確率為94.8%。結論 FQ-PCR檢測MRSA正確率高，只需要1～2 h即可完成。該方法快速、簡便、準確，值得推廣應用。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；MecA基因；Nuc基因；熒光定量聚合酶鏈反應；全自動細菌鑒定和藥敏分析儀

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染和社區(qū)感染的重要病原菌，在金黃色葡萄球菌引起的臨床感染中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)占到了60%～80%[1-4]，并逐年增加。確定金黃色葡萄球菌是否為MRSA對指導臨床合理使用抗生素以及制定防控措施具有重要意義。MecA基因是耐甲氧西林的決定性因素。本研究擬通過對金黃色葡萄球菌臨床分離株MecA、Nuc基因檢測與全自動細菌鑒定和藥敏分析儀結果進行比較，以期選擇出一種簡便、快速、準確檢測MRSA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 180株金黃色葡萄球菌分離自2011年1月—2013年12月為臨床送檢的樣本，樣本類型有血液、尿液、胸腹水、痰液。質控菌金黃色葡萄球菌ATCC25923購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.1.2 儀器 法國生物梅里埃公司全自動細菌鑒定和藥敏分析儀(VITEK COMPACT)；熒光定量聚合酶鏈反應(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)分析儀(SLAN，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因檢測試劑(上海之江生物科技有限公司，批號2014002)。

1.2 方法 細菌分離鑒定按第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行[5]；FQ-PCR檢測MRSA根據試劑盒操作說明書進行，擴增條件為94℃2 min、93℃2 min、62℃30 s，循環(huán)40次，在62℃上機熒光檢測。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件，計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FQ-PCR熒光擴增曲線 耐甲氧西林MecA基因陽性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陽性，熒光曲線均為典型的S形(圖1)。

圖1 MRSA的MecA、Nuc基因雙陽檢測

耐甲氧西林MecA基因陰性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陽性，熒光曲線為典型的S形(圖2)。

耐甲氧西林MecA基因陰性，金黃色葡萄球菌特異性Nuc基因陰性，均無特異性擴增曲線(圖3)。

圖2 MSSA的MecA基因陰性、Nuc基因陽性檢測

圖3 MecA、Nuc基因雙陰檢測

2.2 細菌鑒定和藥敏分析 180株樣本中，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀鑒定，有131株MRSA，檢出率為72.8%；49株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus，MSSA)，檢出率為27.2%。FQ-PCR對180株金黃色葡萄球菌MecA、Nuc基因進行檢測，MecA、Nuc基因檢出率為75.0%(均為陽性即MRSA)。兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05)。如以FQ-PCR法作為MRSA測定的“金標準”，有7株本是MRSA，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀報成MSSA；3株本是MSSA，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀報成MRSA。對錯誤菌株進行校正后全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為71.1%，檢測正確率為94.8%。

3 討論

傳統的MRSA檢測方法有苯唑西林和頭孢西丁紙片擴散法、瓊脂稀釋法、青霉素結合蛋白2a膠乳凝集篩選試驗、微量肉湯稀釋法等[6-7]。這些方法操作費時、費力、判讀不客觀，準確度有待驗證。表型檢測方法受遺傳背景、誘導劑和培養(yǎng)條件等因素影響，使得同一菌株隨培養(yǎng)條件和使用抗生素的不同抗藥性有變化(即異質性)。隨著全自動細菌鑒定儀的普遍使用，許多醫(yī)院已經開始用其取代傳統手工鑒定和藥敏方法。全自動細菌鑒定和藥敏分析儀通常需要48～72 h才能向臨床提供報告，但其對MRSA的確診率是多少、方法的敏感性、特異性如何鮮見報道。

MRSA具有較強的外界適應能力、定植能力和對β-內酰胺類抗生素的耐受能力，其所致感染的流行病學逐漸從過去的院內獲得型逐漸向社區(qū)獲得型轉化。目前認為MecA基因為MRSA耐藥的決定基因，金黃色葡萄球菌一旦獲得MecA基因，即表現為高度耐藥和多重耐藥。Nuc基因是編碼金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的基因，在不同菌株之間具有較高的保守性，是金黃色葡萄球菌特異性基因。用FQ-PCR法聯合檢測MecA、Nuc基因，既保證了金黃色葡萄球菌檢測的特異性，又保證了MRSA檢測的特異性。由于分子生物學方法具有特異、靈敏、快速的特點，與全自動微生物鑒定和藥敏分析儀相比，從理論上更適用于臨床或社區(qū)MRSA感染的快速檢測[8-14]。

本研究使用的180株金黃色葡萄球菌，通過全自動細菌鑒定和藥敏分析儀確認，有131株MRSA、49株MSSA。進一步用FQ-PCR法進行確認后，有7株本是MRSA，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀報成MSSA，MRSA的漏報很有可能造成其傳播，從而引起嚴重院內感染的爆發(fā)；3株本是MSSA，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀報成MRSA，MRSA的錯報可能會導致臨床抗生素的濫用。

FQ-PCR對180株金黃色葡萄球菌的MecA基因檢出率為75.0%，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為72.8%；對全自動細菌鑒定和藥敏分析儀錯誤菌株進行校正后，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對180株金黃色葡萄球菌的MRSA檢出率為71.1%，全自動細菌鑒定和藥敏分析儀對MRSA的檢測正確率為94.8%。

本研究表明，用FQ-PCR檢測金黃色葡萄球菌的MRSA快速、敏感、準確，與國外的研究結果基本一致[15]，可為臨床提供及時的病原菌防控信息，為抗菌藥物的合理使用、院內感染的預防指導提供科學依據。

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Application of MecA and Nuc genes detection in clinical isolated methicillin resistant Staphylococcus aureus

GUO Jianwei，QI Wenfeng，HAO Xiuhong，LI Wenjun，CHEN Changguo，ZHANG Yun，MA Zhijia，CHEN Qiuyuan，ZHAO Qiangyuan
(Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective In order to choose an easier performed rapid and accurate methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA)detection method.MecA and Nuc genes were detected from 180 strains clinical isolated Staphylococcus aureus.Methods Staphylococcus aureus were identified by automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer.MecA and Nuc genes were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)analyzer.Results The expression rate of MecA and Nuc genes in 180 Staphylococcus aureus was 75.0%.MRSA positive rate of 180 Staphylococcus aureus identified by automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer was 72.8%.No difference between automatic bacteria identification and FQ-PCR.The accuracy rate of automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer was 94.8%.Conclusion Detection MRSA according to quantitation of MecA and Nuc genes expression by FQ-PCR has a high accurate rate.The whole experiments would be finished in 1—2 hours.This method is rapidly，easily performed and has a wide application.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)；MecA gene；Nuc gene；Fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)；Automatic bacteria identification and drug sensitivity analyzer

R446.5

B

2095-3097(2017)03-0157-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.007

2016-04-11 本文編輯:張在文)

國家自然科學基金面上項目(30872394)；北京市自然科學基金資助項目(面上項目)(7162188)

100048北京，海軍總醫(yī)院檢驗科(郭建巍，齊文峰，郝秀紅，李文軍，陳昌國，張 云，馬志家，陳秋圓，趙強元)

[注 明]郭建巍，齊文峰:并列第一作者