5-氮胞苷聯合堿性成纖維生長因子誘導人胚胎干細胞定向心肌樣細胞分化的實驗研究

王 力，方志榮，高連如，張寧坤，徐小紅，朱智明

5-氮胞苷聯合堿性成纖維生長因子誘導人胚胎干細胞定向心肌樣細胞分化的實驗研究

王 力，方志榮，高連如，張寧坤，徐小紅，朱智明

目的 探討5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)聯合堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)體外誘導人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)定向分化為心肌樣細胞的可行性。方法 采用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)作為飼養層細胞體外培養hESCs，經懸浮培養形成擬胚體(embryoid bodies，EB)，貼壁后分為無誘導劑組(對照組)、5-aza誘導組、bFGF誘導組、5-aza＋bFGF聯合誘導組4組誘導培養。誘導時間為2周。倒置相差顯微鏡下連續動態觀察細胞形態學變化，并計算各組出現自發搏動的EB，以定量聚合酶鏈反應檢測心肌細胞特異性基因NKX2.5、GATA4、α-actin，免疫熒光法檢測心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)。結果 EB克隆貼壁誘導3～4 d后部分細胞出現自發性節律性搏動，以5-aza＋bFGF聯合誘導組為著。14 d后定量聚合酶鏈反應檢測示5-aza＋bFGF聯合誘導組NKX2.5、GATA4、α-actin表達顯著高于其他3組(P＜0.05)。免疫熒光法示5-aza＋bFGF聯合誘導組cTnT的表達最為明顯(P＜0.05)。結論 hESCs在體外經5-aza＋bFGF聯合誘導后可定向心肌細胞分化，該誘導方案為心肌再生與組織工程領域的研究奠定了基礎。

心肌細胞；細胞分化；人胚胎干細胞；5-氮胞苷；堿性成纖維生長因子

隨著冠心病治療手段的發展，心肌梗死患者早期病死率在1986—2011年的25年間降低了75%，但總體上來看，心肌梗死發病率和病死率仍很高[1]。同時，在已接受冠狀動脈介入治療的患者中，仍有超過30%的患者會出現心肌梗死后心室重構、心力衰竭等諸多并發癥。除了目前臨床上常規的藥物、介入、外科搭橋等治療手段外，再生醫學為冠心病治療領域打開了一扇新的窗戶。

人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)和成體干細胞是心臟再生醫學領域最有希望的細胞源。其中胚胎干細胞具有無限分化能力和增殖能力，從hESCs衍化生成的心肌細胞可以通過細胞移植取代病損心肌而恢復心臟功能[2]，也可以將體外設計好的人工心肌細胞用于心臟體內移植[3]。本研究擬采用5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)及堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)作為誘導劑，探討體外誘導hESCs定向心肌樣細胞分化的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞 hESCs(X-01系)購于上海斯丹賽生物技術有限公司；CF-1系小鼠購于軍事醫學科學院動物研究所[SCXK-(軍)-2013-0007]。

1.1.2 主要實驗試劑 bFGF(美國Invitrogen公司)，Ⅳ型膠原酶、絲裂霉素C、5-aza(美國Sigma公司)，RNA反轉錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A)，互補DNA(complementary DNA，cDNA)擴增試劑盒(SYBR?Premix Ex Taq TMⅡ，RR820A，大連TAKARA公司)，定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)引物由上海生物工程有限公司制備，鼠抗人心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)單克隆抗體、異硫氰酸熒光素標志的羊抗鼠IgG抗體(英國Abcam公司)，實時定量基因擴增儀(CFX96TM，美國Bio-Rad公司)，共聚焦顯微鏡(FV10i，日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細胞培養與飼養層制備 利用12.5～13.5 d胎鼠軀干部晶胚組織制備小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)原代細胞，經傳代培養至P3代，經絲裂霉素C處理后可用于制備hESCs飼養層。具體步驟參考文獻[4]。

1.2.2 hESCs培養與擬胚體制備 hESCs在MEF飼養層上貼壁培養，每天更換新鮮的hESCs完全培養基[5]；待出現分化跡象時采用Ⅳ型膠原酶進行傳代，傳代周期一般為6～7 d，具體步驟參考文獻[5]。進行擬胚體(embryoid bodies，EB)制備時，按傳代步驟洗滌去除MEF細胞，將hESCs克隆吹打至小團塊(15～20個細胞/克隆)，然后用4 mL EB培養液混勻后，以(1～2)×103個克隆/皿懸浮培養于58 mm低黏附性Petri培養皿中。2 d后半量換液，之后每天半量換液1次。一般懸浮培養5～7 d大部分克隆即可形成EB。

1.2.3 EB貼壁接種與誘導培養 將懸浮培養的EB按1～2/cm2接種于基質膠包被的6孔培養板中，每孔2 mL EB培養液并每日更換，貼壁約24 h后分為4組繼續培養:①對照組，每日更換新鮮EB培養液；②5-aza誘導組，每孔加入5 μmol/L 5-aza，24 h后更換為新鮮EB培養液；③bFGF誘導組，每孔加入10 μg/L bFGF，每天更換含bFGF 10 μg/L的EB培養液；④5-aza＋bFGF聯合誘導組，每孔加入5 μmol/L 5-aza和10 μg/L bFGF，24 h后棄除培養基，每日更換含bFGF 10 μg/L的EB培養液。4組細胞置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中連續培養14 d，每12 h觀察1次各組EB克隆分化情況，記錄每個自發搏動EB的初始搏動時間、持續時間及搏動頻率，用標志筆于培養皿底標志出自發搏動的EB位置，避免重復計數，然后對誘導期間的記錄結果進行匯總統計。

1.2.4 qPCR檢測心肌細胞特異性基因表達 從基因文庫中檢索人NKX2.5、GATA4、α-actin基因cDNA序列，應用Primer 5.1軟件設計引物(表1)，內參基因為β-actin。分別于誘導前、誘導7 d、誘導14 d收集各組細胞，按細胞裂解液(Trizol溶液)試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取總RNA。取1.0 μg待檢測RNA樣本，采用RNA反轉錄試劑盒先去除樣本中殘余DNA，再進行反轉錄反應(具體步驟參考RNA反轉錄試劑盒說明書)，反轉錄條件為37℃15 min、85℃5 s，冰浴1～2 min，4℃存放備用。采用實時定量基因擴增儀進行擴增反應(具體步驟參考cDNA擴增試劑盒說明書)，擴增條件為95℃30 s、95℃5 s、60℃30 s，共40個循環。每個樣本設置3個復孔，分析各孔擴增循環數(cycle threshold，CT)，信使RNA相對含量采用標化后的2－ΔΔCT值表示，計算基因初始拷貝數的相對量。

1.2.5 免疫熒光法檢測cTnT表達 取各組誘導14 d的細胞進行細胞爬片，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，然后用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，美國Sigma公司)室溫下滲透化處理10 min，10%正常山羊血清室溫封閉30 min，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗2遍后加入鼠抗人cTnT單克隆抗體稀釋液(稀釋比例1∶200)，4℃孵育過夜。PBS洗3遍后加入異硫氰酸熒光素標志的羊抗鼠IgG抗體稀釋液(稀釋比例1∶200)，室溫孵育30 min。然后用1.5 μg/mL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染色液進行染核。共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞的熒光表達情況，同時每組細胞隨機選取3張爬片，在共聚焦顯微鏡下觀察并計算綠色熒光陽性細胞比例。采用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。每個樣本均重復3次以上。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，單個時間點的多組數據間比較或單組內不同時間點數據間比較，若符合正態分布且方差齊性采用單因素方差分析，否則采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(非參數檢驗)；重復測量資料的多組數據間比較采用單變量方差分析；計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 目的基因引物序列

2 結果

2.1 分化前hESCs形態學特征 低倍鏡下觀察體外培養的未分化hESCs呈扁平狀類圓形克隆形式貼壁生長，克隆周圍可見少量單個hESC以及少量成纖維細胞樣的自行分化細胞，與MEF細胞界限清晰(圖1A)。高倍鏡下觀察細胞核較大，核質比高，細胞表面有折光性好的脂狀小滴(圖1B)。

圖1 光鏡下X-01系hESCs

2.2 EB形態學特征 hESCs克隆懸浮生長2～3 d后，大部分克隆出現細胞密度不均，外層細胞較大，細胞界限清楚(即內胚層樣細胞)；中心密度較高，細胞界限不清，為未分化的緊密細胞團，即簡單EB (圖2A)。約4 d后大部分克隆內部開始出現囊腔形成，并隨著時間進展腔隙逐漸增大，即囊狀EB (圖2B)，極少數囊狀EB出現區域性自發搏動。轉為貼壁培養并加入誘導劑誘導分化后1～2 d，EB周圍細胞爬出貼壁形成成纖維樣細胞，5～7 d后部分EB出現節律性自發搏動并持續至2周(圖2C)。

圖2 光鏡下EB形態學特征

2.3 不同誘導處理對EB自發搏動的影響 不同誘導處理EB數量、搏動時間及搏動頻率見表2。各組hESCs克隆在懸浮培養形成囊狀EB，形成率為50.0%～54.3%，各組發生率差異無統計學意義(χ2＝0.30，P＞0.05)；各組均有少量EB自行分化出現自發搏動，發生率為2.8%～4.2%，差異無統計學意義(χ2＝1.13，P＞0.05)；搏動頻率在50～67/min。誘導后節律性搏動EB發生率為2.7%～52.8%，各組發生率差異有統計學意義(χ2＝18.77，P＜0.01)，其中5-aza＋bFGF聯合誘導組誘導成功率顯著高于其他各組。另外，在5-aza＋bFGF聯合誘導組誘導成功的EB中，節律性搏動持續時間(F＝49.55，P＜0.05)及搏動頻率(F＝62.79，P＜0.05)均明顯高于其他各組。

2.4 心肌細胞特異性基因表達 誘導實驗前，NKX2.5、GATA4、α-actin基因在各組細胞中的表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。除對照組α-actin基因無明顯增加(F＝4.28，P＞0.05)外，其他各組細胞中3種基因的相對表達量均隨著誘導時間的延長而增加(P＜0.05)。誘導后7 d，3個誘導組NKX2.5基因表達量較對照組差異無統計學意義(F＝73.24，P＞0.05)。誘導后14 d，除bFGF誘導組外，5-aza誘導組及5-aza＋bFGF聯合誘導組中NKX2.5基因均有明顯升高，且2組差異有統計學意義(F＝88.81，P＜0.01)；其中，5-aza＋bFGF聯合誘導組約為對照組的3.75倍，5-aza誘導組約為對照組的2.5倍。3個誘導組GATA4基因表達量分別在誘導后7 d(F＝28.96，P＜0.01)及14 d(F＝54.81，P＜0.01)時較對照組差異均有統計學意義，5-aza＋bFGF聯合誘導組中約為對照組的4.15倍、5-aza誘導組約為對照組的3.45倍。3個誘導組α-actin基因表達量分別在誘導后7 d(F＝14.65，P＜0.05)及14 d(F＝32.99，P＜0.01)時較對照組差異均有統計學意義；5-aza＋bFGF聯合誘導組約為對照組的5.39倍；5-aza誘導組及bFGF誘導組次之，但2組間差異無統計意義(P＞0.05)。見表3。

表2 各組EB形成及搏動情況

表3 qPCR檢測各組細胞基因相對表達量

2.5 免疫熒光檢測cTnT cTnT各組表達量綠色熒光陽性細胞見圖3，4組熒光細胞比例分別為(13.11± 4.97)%、(29.19±7.06)%、(23.17±8.35)%、(44.92± 6.02)%，其中5-aza＋bFGF聯合誘導組顯著高于其他各組(F＝11.79，P＜0.01)。

圖3 免疫熒光檢測cTnT的表達(×200)

3 討論

目前，體外誘導干細胞定向心肌細胞分化的實驗方法主要包括添加誘導劑、模擬心肌微環境、基因修飾與調控等。文獻已報道的誘導劑包括5-aza、bFGF、血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子、骨形態發生蛋白2、轉化生長因子-β1、二甲基亞砜、血管緊張素Ⅱ等[6-8]。其中，關于5-aza誘導心肌分化的研究最多，5-aza誘導濃度3～10 μmol/L不等，濃度高于10 μmol/L時細胞死亡率增加，進而影響誘導分化率；誘導時間窗大多在接種細胞后24～72 h，過早誘導會出現細胞死亡率增加，而接種96 h后則易出現過多自行分化；誘導持續時間多在24 h左右，持續時間過長易導致細胞過多死亡，而持續時間過短影響誘導分化率；誘導效率維持在30%～60%[9-12]。5-aza的誘導機制主要與DNA鏈的甲基化有關。哺乳動物細胞的DNA甲基化程度通常與CpG堿基對中的胞核嘧啶堿基有關，CpG通常存在于基因啟動子區域，控制下游基因的轉錄[13]。CpG堿基對通常處于甲基化狀態，一旦去甲基化后可引起大量基因表達，而5-aza可使DNA鏈中的5-甲基胞嘧啶去甲基化，并通過非競爭性抑制DNA甲基化酶使基因去甲基化，引起基因激活和表達從而促進細胞分化[14]。Ruan等[10]認為5-aza可能通過調控心肌早期轉錄因子NKX2.5、GATA4促進干細胞定向心肌細胞分化，同時DLL4-Notch通路也參與該過程。

多項實驗研究證實，采用5-aza與其他誘導劑聯合處理干細胞可以提高心肌樣細胞誘導成功率[6-7，9，11]。bFGF作為一種多能有絲分裂原，可參與多種細胞的增生、分化、黏附、遷移以及凋亡過程[15]。Xu等[9]發現bFGF和5-aza聯合誘導，有助于分化干細胞表達心肌細胞表型，同時可避免5-aza單獨誘導時出現的誘導細胞空泡化、降解或生長狀態差等情況，是一種較為理想的心肌誘導方案。

然而，Kawano等[16]認為所有體外誘導胚胎干細胞定向心肌細胞分化的誘導劑只能提高誘導細胞中心肌樣細胞在整個分化細胞群落中的比例，不能形成穩定的具有完整生理學特性的心肌細胞及組織；同時，誘導劑導致的胚胎細胞特定基因表達的改變存在一定安全風險，有可能導致移植后畸胎瘤的發生。李獻帥等[17]利用不加任何誘導劑的懸浮培養法，體外誘導hESCs分化為心肌細胞，分化率為20.8%，避免了誘導劑分化帶來的安全性問題。李衛東等[18]將小鼠胚胎干細胞懸浮培養形成EB后，再與新生大鼠心肌細胞共培養，實驗組約有93%的EB出現自發性搏動，最終心肌細胞分化率達56.5%，提示細胞之間的接觸培養在胚胎干細胞心肌樣定向分化中起重要作用。Huber等[19]利用慢病毒載體將人類心臟發育的特異啟動子——肌球蛋白輕鏈-2v基因轉入hESCs，在心肌特異性基因及蛋白表達(＞93%)、心肌動作電位、移植后基因穩定表達方面具有明顯的優勢。

本實驗采用5-aza(5 μmol/L)聯合bFGF(10 μg/L)對hESCs進行心肌細胞定向誘導分化，結果表明與單純5-aza誘導組及單純bFGF誘導組相比，5-aza＋bFGF聯合誘導組在誘導節律性搏動EB數量、搏動持續時間、搏動頻率方面均具有明顯優勢，誘導細胞表達心肌特異性基因及蛋白水平高，誘導結果較為穩定，適合作為心肌誘導的研究平臺方案。

目前，各種誘導劑誘導胚胎干細胞向心肌分化的確切機制尚不完全清楚。同時，如何高效、安全地誘導分化、富集hESCs源心肌細胞，并將之應用于心肌修復組織工程仍然需要進一步的探索與研究。

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Differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocyte-like cells induced by 5-azacytidine combined with basic fibroblast growth factor

WANG Li1，FANG Zhirong1，GAO Lianru2，ZHANG Ningkun2，XU Xiaohong2，ZHU Zhiming2
(1.Department of Internal Medicine，the 413th Hospital of PLA，Zhoushan Zhejiang 316000，China；2.Department of Cardiology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To investigate the feasibility and optimal induction protocol containing 5-azacytidine(5-aza)and basic fibroblast growth factor(bFGF)，which were used to induce human embryonic stem cells(hESCs)to differentiate into cardiomyocyte-like cells.Methods Human ESCs were cultured on mouse embryonic fibroblasts(MEF)feeder layers.After suspension culture，embryoid bodies(EB)were formed and divided into 4 groups with different inducing methods:①no-reagent group(control group)；②5-aza induced group；③bFGF induced group；④combined (5-aza and bFGF)induction group.Following a two-week induction period，the dynamic changes in morphology were detected by inverted phase-contrast microscopy and spontaneous-beating EBs were calculated in different groups.Expression of cardic-specific genes(NKX2.5，GATA-4，α-cardiac actin)and cardic-specific protein(cTnT)were respectively analysed by quantitative poly merase chain reaction(qPCR)and immunoflourescent technique.Results About 3—4 days later，parts of EB showed spontaneous beating，especially observed in combined induction group.Two weeks after induction，qPCR analysis showed that mRNA expression of NKX2.5，GATA4，α-actin in combined induction group were significantly higher than those in other groups(P＜0.05).Immunoflourescence analysis showed that expression of cTnT protein in combined induction group also significantly higher than that in that groups(P＜0.05).Conclusion Human ESCs could be differentiate into cardiomyocyte-like cells inducing by 5-aza combined with bFGF in vitro，which established the foundation for the research of myocardial regeneration and tissue engineering.

Cardiomyocyte；Cell differentiation；Human embryonic stem cells(hESCs)；5-azacytidine(5-aza)；Basic fibroblast growth factor(bFGF)

R394.26

]A< class="emphasis_bold">[文章編號]2

2095-3097(2017)03-0137-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.003

2017-02-15 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金面上項目(81170094)

316000浙江舟山，解放軍第四一三醫院內科(王 力，方志榮)；100048北京，海軍總醫院心血管內科(高連如，張寧坤，徐小紅，朱智明)

朱智明，E-mail:zhuzhiming6542＠sina.com.cn