熱性驚厥患兒人類皰疹病毒6型感染的檢測分析

孫巖+王鋒+于靜+馬蘭紅+古麗比亞+余亮+羅新輝+孫荷

摘要：目的 了解熱性驚厥患兒人類皰疹病毒6型（HHV-6）的感染情況。方法 采集患兒血清及腦脊液樣本，采用間接免疫熒光法檢測樣本中的HHV-6 IgM、IgG抗體，采用巢氏PCR法檢測樣本中的HHV-6 DNA。結果 熱性驚厥患兒血清HHV-6 IgM陽性率為17.00%（9/53），IgG陽性率為66.00%（35/53）；腦脊液HHV-6 IgM和IgG均未檢出陽性。血清樣本中，HHV-6 DNA擴增陽性率為18.90%（10/53），其中有7例IgM為陽性，95份腦脊液樣本均未擴增出HHV-6 DNA。結論 熱性驚厥和HHV-6感染可能有相關性，但本研究僅在部分熱性驚厥患兒血清中查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，腦脊液樣本均未查出HHV-6 IgM或HHV-6 DNA，因此本研究未能證實HHV-6的噬神經特點，有待加大樣本量進一步深入研究。

關鍵詞：兒童；熱性驚厥；皰疹病毒6型

Abstract：Objective To investigate the effects of febrile seizures in children with human herpes simplex virus type 6（HHV-6）infection.Methods Serum and CSF samples were collected and detected by indirect immunofluorescence assay in samples of HHV-6 IgM，IgG antibody，using nested PCR method to detect the samples of HHV-6 DNA.Results the positive rate of serum HHV-6 in children with febrile convulsion（9/53）of IgM was 17.00%， IgG positive rate was 66.00%（35/53）；Cerebrospinal fluid HHV-6 IgM and IgG were not detected positive.The positive rate of HHV-6 DNA amplification was 18.90%（10/53）in serum samples.Among them，IgM was positive in 7 cases and HHV-6 DNA was not amplified in 95 cerebrospinal fluid samples.Conclusion Febrile convulsion and HHV-6 infection may have a correlation，but only part of this study in the serum of children with febrile convulsion was found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，cerebrospinal fluid samples were not found in HHV-6 IgM or HHV-6 DNA，so this study failed to confirm the neuronophagia characteristics of HHV-6，to add a large sample of further research.

Key words：Children；Febrile convulsion；Herpesvirus 6

1986年Sslahuddin等發現了一種具有皰疹病毒形態和嗜淋巴細胞的新病毒，最初認為該病毒只感染新鮮分離的B淋巴細胞，曾被命名為人嗜B淋巴細胞病毒，后來人們發現它與皰疹病毒科中的其它病毒抗原性和酶切圖譜不同，故更名為人皰疹病毒6型（Human herpesvirus-6， HHV-6），此后世界各地又陸續分離出一些毒株，進一步研究發現HHV-6分為兩個亞型，即A組（GS株）和B組（Z29株）[1]。HHV-6屬于人類皰疹病毒 亞族，這一亞族病毒的細胞感染范圍廣，致病性尚未完全了解，其感染與臨床上許多疾病有關，如幼兒急疹、慢性疲勞綜合征等[2]，有研究表明，部分3歲以內患兒伴發熱的嚴重驚厥或擬似腦炎與HHV-6感染相關[3]。本研究通過了解熱性驚厥患兒HHV-6感染情況，探討患兒熱性驚厥與HHV-6感染的關系。

1資料與方法

1.1一般資料 2010年9月～2015年3月在新疆維吾爾自治區人民醫院兒科就診的高熱驚厥兒童共95例，其中腦脊液和血清標本都有的53例，其它42例僅有腦脊液（未收集到血清），其中男童48例，女童47例；維吾爾族52例，漢族26例，回族8例，哈薩克族9例。納入標準：年齡為新生兒～14歲，有高熱驚厥癥狀；排除標準：被診斷為結核性腦炎、細菌性腦炎及非感染性腦炎患兒。

1.2方法

1.2.1標本的采集 在發熱3 d內采集患兒靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉無菌抗凝，分離血清，4℃保存備用；腦脊液標本的收集：留取2 ml以上腦脊液放入無菌試管中，4℃保存備用。

1.2.2實驗室檢測 采用間接免疫熒光法檢測患兒血清及腦脊液中HHV-6 IgM、IgG抗體，間接免疫熒光法檢測試劑盒購自歐盟醫學診斷（中國）有限公司，將血清或腦脊液用吸附劑按1：10稀釋，混勻后，點于載玻片上，37 ℃溫育90 min，用PBS洗3次，加入含有伊文斯藍的熒光素標記抗人IgM或IgG FITC結合物，37℃孵育30 min，用PBS洗3次，用蒸餾水脫去鹽分1次。風干后封片，在熒光顯微鏡下讀片，放大倍數400倍，熒光顯微鏡下細胞膜、胞漿或細胞核可見綠色熒光判為陽性，試劑盒提供陽性及陰性對照做質控。血清和腦脊液的IgM、IgG均按照1：10滴度進行檢測。

采用巢氏PCR法檢測所有樣本中HHV-6 DNA。試劑盒提取血清及CSF中HHV-6 DNA，置-20℃備用，根據HHV-6大衣殼蛋白基因（LTP gene）的DNA序列設計一對外引物和一對內引物，各引物序列，見表1。外（內）引物PCR反應體系為：上游引物10 μmol，下游引物10 μmol，Taq DNA聚合酶 1U，dNTP 20 mmol，Mgcl2 30 mmol，10×PCR Buffer 2.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O補足至20 μl。外引物、內引物PCR的反應參數均為：94℃預變性5 min；（94℃ 35 s，55℃ 45 s ，72℃ 55s），共35個循環；72℃總延伸8min，取10 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，見表1。

1.2.3統計學方法 采用EXECL2003和SPSS16.0軟件進行數據收集和處理。

2結果

2.1間接免疫熒光法 熱性驚厥患兒血清HHV-6 IgM陽性率為17.00%（9/53），IgG陽性率為66.00%（35/53）；腦脊液HHV-6 IgM和IgG均未檢出陽性。

2.2巢氏PCR法 取10 μl PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90V 30 min，凝膠成像系統觀察電泳條帶并拍照，外引物PCR產物片段為287 bp，內引物PCR產物片段為163 bp，見圖1。

53例血清中，巢氏PCR陽性10例，陽性率為18.9%，其中8例年齡在1歲以下，10例中有7例的間接免疫熒光法結果為陽性，提示巢氏PCR法敏感性高于間接免疫熒光法。95例腦脊液樣本均未擴增出HHV-6 DNA。

3討論

兒童熱性驚厥的發病機制尚不明確，可能與遺傳、感染、免疫、發熱等有關。首次熱性驚厥患兒年齡在2個月～6歲，發病高峰期是1～2歲，呼吸道感染、幼兒急診、急性中耳炎與熱性驚厥的發生有關，孫冬青等報道94.70%的首次熱性驚厥患兒患有呼吸道感染或幼兒急疹，首次熱性驚厥患兒與HHV-6感染合并率為34.7%[4]，本研究在18.90%的熱性驚厥患兒中擴增出了HHV-6 DNA，其中的大部分患兒都<1歲，提示HHV-6感染與熱性驚厥的發生相關，如果<1歲的兒童首次發生熱性驚厥時，應考慮到HHV-6感染。

國外一些研究也證實HHV-6有噬神經的特點，但大部分熱性驚厥患兒只能從血液中查到HHV-6，在腦脊液中很難檢出HHV-6 DNA[5]，也有在腦脊液中檢出HHV-6 DNA的報道，如Kondo等對僅有一次熱性痙攣發作的患兒腦脊液進行檢測，HHV-6 DNA都為陰性[6]，但幼兒急疹患病后熱性痙攣反復發作3次以上者，腦脊液中HHV-6 DNA檢出率很高，據此他推測HHV-6在原發感染后形成潛伏感染，反復的熱性驚厥可能與潛伏的HHV-6被激活有關[7]。本研究結果顯示，熱性驚厥與HHV-6感染有相關性，但僅在部分熱性驚厥病例血清中查出HHV-6 IgM抗體或HHV-6 DNA，在滴度為1：10時95例熱性驚厥患兒腦脊液IgG抗體均為陰性，且通過巢氏PCR檢測所有腦脊液中均未擴增出HHV-6 DNA，因此本研究未能證實HHV-6的噬神經特點，有待加大樣本量進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Joshua A.hill，Nagagopal venna.Human herpesvirus 6 and the nervous system [J].Handbook of Clinical Neurology，2014，123（2）：327-355.

[2]D.A.Clark.Clinical and laboratory features of human herpesvirus 6 chromosomalintegration [J].Clin Microbiol Infect，2016，22：333-339.

[3]Shiho Yamamoto，Satoru Takahashi，Ryosuke Tanaka，et al.Human herpesvirus-6 infection-associated acute encephalopathy without skin rash [J].Brain and Development，2015，37：829-832.

[4]張冬青，孫若鵬.首次熱性驚厥與人皰疹病毒6型感染的關系[J].山東大學學報（醫學版），2008，46（2）：185-187.

[5]Joshua A.Hill，Michael J.Boeckh，Ruth Hall Sedlak，et al.Human herpesvirus 6 can be detected in cerebrospinaluid without associated symptoms after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J].Journal of Clinical Virology，2014，61：289-292.

[6]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Association of HHV-6 infection of the central nervous system with recurrence of febrile convulsions[J].J lnfect Dis，1993，167：1197-1200.

[7]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Prevalence of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus 6 in Patients with Human Herpesvirus 6 Central Nervous System Dysfunction[J].Biol Blood Marrow Transplant，2015，21：364-381.

編輯/李樺