TFDG對IL-1β體外誘導大鼠軟骨細胞炎性損傷的保護作用研究

周盈，黃倩，張甜，陳萍*

1. 浙江大學茶學系，浙江 杭州 310058；2. 浙江大學基礎醫學院，浙江 杭州 310058

TFDG對IL-1β體外誘導大鼠軟骨細胞炎性損傷的保護作用研究

周盈1，黃倩2，張甜1，陳萍1*

1. 浙江大學茶學系，浙江 杭州 310058；2. 浙江大學基礎醫學院，浙江 杭州 310058

體外分離培養SD雄性大鼠膝關節軟骨細胞，經甲苯胺藍及II型膠原（Col II）免疫熒光染色鑒定后，加入白介素-1β（IL-1β）誘導建立骨關節炎（OA）細胞模型，探討茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）對OA軟骨細胞的保護作用。細胞形態觀察發現TFDG能明顯改善OA軟骨細胞形態。實時熒光定量PCR（Real-time PCR）結果顯示，TFDG不僅可以上調軟骨細胞分子標志物Col II mRNA的表達，還可以下調炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA的表達。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測結果進一步表明TFDG可明顯降低炎癥因子的分泌。免疫印跡（Western blot）檢測結果證明，TFDG預干擾可降低炎癥誘導酶環氧化酶COX-2蛋白表達量。這些結果說明TFDG通過減弱炎癥反應，從而對IL-1β體外誘導大鼠軟骨細胞炎性損傷起到保護作用。

茶黃素雙沒食子酸酯；骨關節炎；軟骨細胞；炎癥

骨關節炎（Osteoarthritis, OA）是最常見的慢性關節疾病，隨著年齡的增長，其發病率會逐漸上升，嚴重危害中老年人的健康[1-3]。關節軟骨損傷是骨關節炎最主要的生理病變之一，增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常等諸多因素均可引起關節磨損損傷，最終導致關節軟骨退行性變和繼發性骨質增生[4-5]。軟骨細胞作為關節軟骨中唯一一種細胞，調節胞外基質（Extracellular matrix, ECM）的合成和降解，維持軟骨基質穩態[6-7]。軟骨細胞形態及功能的異常是OA病變的主要因素[8-9]。現階段骨關節炎的體外研究主要集中在動物關節軟骨細胞的培養及白介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）體外誘導成模，該模型現已被廣泛應用和認可[10-11]。

茶黃素是紅茶的主要功能成分，由兒茶素和沒食子酸等酚類物質氧化形成，其最主要的單體有4種：茶黃素（Theaflavin, TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-monogallate, TF-3-G）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavin-3′-monogallate, TF-3′-G）及茶黃素雙沒食子酸酯（Theaflavin-3, 3′-digallate, TFDG）。現已發現，茶黃素具有抗氧化、調節炎性反應、預防心血管疾病、抗腫瘤等藥理功能[12]。劉偉等研究認為[13]，茶黃素分子活性主要來源于沒食子酰基等基團所含的酚羥基，隨著茶黃素沒食子酸酯化程度的提高，其生理活性明顯增強。在茶黃素的4種主要單體中，TFDG單體的酚羥基最多，可能具有較強的生理活性。已有研究發現[14-16]，以EGCG為主的綠茶多酚對骨關節炎的防治作用，是通過促進軟骨細胞增殖和軟骨細胞胞外基質合成，并減少炎癥因子的分泌實現的，但目前對茶黃素的相關研究鮮有報道。因此，本實驗用IL-1β對體外分離培養的大鼠軟骨細胞進行誘導，建立OA細胞模型，初步探討TFDG對OA軟骨細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和實驗動物

TFDG標準品（純度≥98%，上海源葉生物有限公司），用無菌磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline, PBS）溶解稀釋，－20℃避光保存備用。

胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）、DEME/F12培養液、雙抗溶液（青霉素/鏈霉素）、PBS、胰酶、混合膠原酶（均購自美國Gibco公司）；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）（美國Sigma公司）；重組大鼠IL-1β（英國Peorotech公司）；抗熒光淬滅封片液、DAPI（均購自上海碧云天公司）；II型膠原抗體（美國Santa Cruz公司）；COX-2抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗小鼠IgG抗體（均購自美國CST公司）；山羊抗兔Dylight 488熒光二抗（美國Abcam公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；SYBR? Green Supermix試劑盒（美國Bio-Rad公司）；ReverTra Ace?（日本ToYoBo公司）；實時熒光定量PCR引物（中國上海生物工程技術有限公司）；大鼠IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

實驗動物采用清潔級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質量120～150 g，約40只，來源于浙江省實驗動物中心。所有動物實驗的操作均經過浙江大學動物中心倫理委員會批準。

1.2 主要儀器

JB-CJ-1FX超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）、Galaxy系列二氧化碳培養箱（英國RS Biotech公司）、Nikon倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）、Western blot電泳轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）、NanoDrop蛋白核酸定量儀（美國NanoDrop公司）、480 II熒光定量PCR儀（美國Roche公司）、G:BOX化學發光成像儀（英國Syngene公司）。

1.3 軟骨細胞分離培養

用10%水合氯醛將SD大鼠麻醉致死后，用75%酒精浸泡10 min。無菌條件下打開膝關節，分離關節軟骨面，轉移至超凈工作臺做如下操作：滅菌手術刀削下關節軟骨碎片，剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，加入2 mL 0.2%混合膠原酶，37℃消化30 min，轉移到含3 mL完全培養基（含10% FBS和1%雙抗）的6 cm培養皿中培養。24 h后，將組織懸液轉移至15 mL離心管，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養基重懸細胞后，轉移至原6 cm培養皿，37℃、5% CO2培養箱進行常規培養。待貼壁細胞長滿80%左右進行傳代，期間每隔2 d進行細胞換液。

1.4 實驗分組及處理

待大鼠第一代軟骨細胞長滿約80%時，經胰酶消化后形成細胞懸液，并以每孔1×106個接種到六孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱中進行常規培養。按照說明書用0.1% BSA溶解IL-1β。實驗分3個處理組：空白對照組、IL-1β誘導組及TFDG組。待細胞長滿80%～90%時，更換無血清培養基饑餓處理細胞12 h，使細胞同步于增殖相。干預組加入不同濃度的TFDG（25、50、75、100 μmol·L-1）預處理2 h后，再加入終質量濃度為10 ng·mL-1的IL-1β，模型組僅加入同濃度IL-1β和PBS，對照組加入相同體積PBS，各組細胞培養基總體積一致，細胞培養24 h后，觀察并記錄3個處理組細胞形態特征。

1.5 軟骨細胞爬片和培養

待大鼠第一代軟骨細胞長滿約80%時，經胰酶消化后形成細胞懸液，并以每孔2×104個接種到鋪有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱中爬片培養24 h。待細胞貼壁完成后，取出爬片，用于軟骨細胞染色鑒定。

1.6 甲苯胺藍染色

取出制備好的第二代細胞爬片，95%乙醇4℃固定30 min，PBS清洗2次，用體積分數為1%的甲苯胺藍乙醇液染色20 min，PBS清洗2次，無水乙醇漂洗，空氣中干燥，中性樹膠封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 II型膠原免疫熒光染色

將制備好的第二代細胞爬片用PBS-BSA（用PBS配制1% BSA）孵育細胞15 min，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min。棄多聚甲醛，PBS清洗3次，0.2% Triton-X-100通透細胞10 min。PBS清洗2次，PBS-BSA封閉15 min。PBS清洗2次，加入II型膠原抗體4℃孵育過夜，翌日PBS清洗3次后，加入山羊抗兔Dylight 488熒光二抗室溫避光孵育1 h。PBST清洗3次后，DAPI染核30 min。滴入防淬滅劑，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 ELISA檢測

軟骨細胞以每孔1×106個接種于六孔板中，待細胞長滿80%～90%時，更換無血清的培養基孵育12 h，使細胞同步于增殖相，按不同組別進行相應處理，培養24 h后，以無菌管收集細胞培養基上清。嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，繪制出標準曲線，測定細胞培養基中IL-1β和IL-6的含量。實驗重復4次，每次各組設3個復孔。

1.9 Western blot檢測

第二代大鼠軟骨細胞培養于六孔板內，按不同組別進行相應處理。24 h后，棄培養基，PBS清洗2次，用RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，刮下細胞后將其轉移至1.5 mL離心管中，4℃ 13 000 r·min-1離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含40 μg蛋白質的上樣量，經由8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）恒壓100 V進行電泳。恒流250 mA PVDF膜轉膜2 h，5%～10%脫脂奶粉封閉1 h。洗膜后加入COX-2、GAPDH抗體4℃孵育過夜。翌日再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后加Immobilon顯色液，G:BOX化學發光成像儀曝光顯示目的蛋白，并拍照記錄。用ImageJ軟件對圖像進行數據轉化處理，以目的條帶和內參條帶的灰度值比值作為結果，實驗重復3次。

1.10 Real-time PCR檢測

用trizol收集各組細胞，采用trizol法提取各組軟骨細胞總RNA，NanoDrop蛋白核酸定量儀測RNA濃度。取1 μg總RNA采用ReverTra Ace?逆轉錄試劑盒制備cDNA模板。參考Bio-Rad公司Real-time PCR試劑盒構建10 μL反應體系，反應條件如下：95℃變性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸30 s，共40個循環。每次Real-time PCR至少為3個不同樣本。選用大鼠管家基因GAPDH作為內參，將所得樣本的Ct值按公式2–ΔΔCT計算IL-1β、IL-6和Col II相對表達量，實驗重復3～4次，每次各處理組設3個復孔。本實驗Real-time PCR所用引物通過查閱相關文獻獲得（表1）。

1.11 統計學方法

統計分析采用Graphpad prism 5軟件處理，實驗數據均以平均數±標準差（Mean±SD）表示，采用Student t test進行分析，P＜0.05表示有統計學意義。

表1 本實驗中使用的Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primers used in this experiment

2 結果與分析

2.1 軟骨細胞的鑒定

蛋白聚糖和II型膠原的合成和分泌是軟骨細胞維持其分化表型的特征性指標，可用于軟骨細胞鑒定。實驗結果如圖1所示。軟骨細胞貼壁固定后，經甲苯胺藍染色，可見胞內藍紫色異染顆粒，細胞核染成藍紫色，細胞質呈藍色。軟骨細胞核經DAPI染色后呈藍色，細胞質經Dylight 488染色后呈綠色。由此可見，本實驗提取得到了純凈的軟骨細胞，特征性II型膠原主要分布在胞漿和細胞膜上。

圖1 軟骨細胞鑒定Fig. 1 Identification of chondrocytes

2.2 TFDG對軟骨細胞形態的影響

軟骨細胞以每孔1×106個的細胞密度培養在六孔板中，待細胞在皿底鋪至80%～90%時，分組做相應處理。24 h后，鏡下觀察結果如圖2所示，空白對照組軟骨細胞外觀多為圓形或多角形，匯合成片呈現“鋪路石”狀。IL-1β誘導組的軟骨細胞大多呈現為長梭形，圓形或多角形細胞數量減少。50 μmol·L-1TFDG組軟骨細胞形態較IL-1β誘導組明顯得到改善，長梭形細胞減少。

圖2 軟骨細胞形態觀察Fig. 2 Morphological observation of chondrocytes

2.3 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞Col II mRNA表達的影響

II型膠原（Type II collage, Col II）為軟骨胞外基質ECM膠原成分的主要類型，參與軟骨細胞合成代謝，對維持關節軟骨合成與分解代謝穩態起重要作用[17]。Real-time PCR結果如圖3所示。與空白對照組相比，IL-1β誘導組中II型膠原表達降低（P＜0.05）；而與IL-1β誘導組相比，TFDG能有效抑制IL-1β引起的Col II表達的降低（P＜0.05），且抑制效果呈濃度依賴性，說明TFDG具有通過上調ECM中Col II的水平，促進骨關節炎中受損軟骨細胞的修復。

2.4 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響

提取軟骨細胞總RNA進行Real-time PCR分析，檢測TFDG對OA軟骨細胞中炎癥因子活性的影響。如圖4所示，正常大鼠軟骨細胞經IL-1β誘導24 h后，IL-1β和IL-6的表達均顯著增加（P＜0.001或P＜0.01)。與IL-1β誘導組相比，軟骨細胞預孵不同濃度的TFDG 2 h再加入IL-1β共培養24 h后，IL-1β和IL-6的表達均受到顯著抑制，且抑制效果呈現出濃度依賴關系。結果表明，TFDG通過抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞IL-1β和IL-6表達，表現出明顯的抗炎活性。

圖3 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞Col II mRNA表達的影響Fig. 3 Effect of TFDG on IL-1β-induced Col II mRNA expression in rat chondrocytes

圖4 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響Fig. 4 Effect of TFDG on IL-1β-induced IL-1β and IL-6 mRNA expression in rat chondrocytes

2.5 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞IL-1β和IL-6蛋白表達的影響

軟骨細胞分組做相應處理后，收集細胞培養液，離心取上清液，測定細胞炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌量，結果見圖5。在空白對照組中，體外培養的正常大鼠軟骨細胞中IL-1β和IL-6的含量很少。IL-1β處理大鼠軟骨細胞24 h后，炎癥因子的蛋白表達量顯著增加（P＜0.001）。軟骨細胞經不同濃度的TFDG預處理2 h，再加入IL-1β共培養24 h后，發現IL-1β和IL-6的蛋白含量均呈濃度依賴性的顯著降低。提示TFDG可抑制IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞中IL-1β和IL-6的分泌量，進一步表現抗炎活性。

圖5 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞IL-1β和IL-6蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of TFDG on IL-1β-induced the protein level of IL-1β and IL-6 expression in rat chondrocytes

2.6 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞COX-2蛋白表達的影響

IL-1β作用于軟骨細胞后，可上調環氧合酶2（Cyclooxygenase-2, COX-2）的表達，刺激炎性介質如前列腺素E2（Prostaglandin E2, PGE2）的釋放，加速OA發生發展[18]。實驗采用Western blot方法檢測了TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞COX-2表達的影響。結果由圖6-A可知，在TFDG預處理組中，大鼠軟骨細胞COX-2的蛋白豐度相較于IL-1β刺激組明顯降低。用ImageJ軟件對圖像進行數據處理，結果（圖6-B）顯示，大鼠軟骨細胞經IL-1β誘導后COX-2表達量顯著增加（P＜0.01）。預孵TFDG 2 h后經IL-1β誘導培養24 h，發現COX-2表達量呈濃度依賴性顯著降低。說明TFDG能夠明顯下調IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞COX-2表達。

圖6 TFDG對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞COX-2蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of TFDG on IL-1β-induced the protein level of COX-2 expression in rat chondrocytes

3 討論

TFDG是一種存在于紅茶中的天然化合物，其分子結構中含有沒食子酰基及多個酚羥基，在炎癥調節方面表現出良好的生理活性[19-21]。有研究指出TFDG可抑制軟骨細胞基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）活性而起到預防風濕性關節炎的作用[21]。本實驗證實分離培養的細胞是軟骨細胞。細胞形態學觀察結果顯示，軟骨細胞經IL-1β誘導后細胞形態發生改變，由橢圓形變成長梭形。TFDG預干擾后，長梭形細胞比例降低，細胞形態得到明顯改善。

骨關節炎是一種隨年齡增長、發病率明顯增加的退行性關節疾病，驅動OA進程的主要因素是慢性炎癥和關節軟骨胞外基質結構的改變[22-23]。炎癥因子IL-1β通過惡化軟骨細胞生存的微環境，干擾軟骨細胞正常功能，引起關節軟骨退變，加速骨關節炎病理進展。由此可見，控制軟骨細胞的炎癥反應有利于控制或延緩骨關節炎進展，并可能成為治療OA的關鍵環節。Leong D J等[24]在小鼠骨關節炎體內實驗中發現，綠茶多酚通過抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達而減緩疼痛。袁昊等[25]認為，白藜蘆醇也可以通過降低軟骨細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達，延緩軟骨細胞退變。本實驗結果顯示，TFDG可有效阻斷IL-1β誘導的軟骨細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6的表達及分泌，表現出明顯的抗炎活性，且抑制效果具有濃度依賴性。

Huang H等[14]的研究結果顯示，IL-1β可抑制軟骨細胞Col II的表達。本研究結果與之一致，且發現TFDG還通過上調OA軟骨細胞中Col II mRNA表達，改善細胞外基質降解現象。童敏等[26]認為，白藜蘆醇可通過下調COX-2在關節軟骨中的表達達到調控骨關節炎的作用。本研究結果顯示，COX-2在正常軟骨細胞中表達量極低，IL-1β刺激能明顯上調其蛋白表達量。而TFDG預干擾能有效降低OA軟骨細胞中COX-2蛋白表達量，進而減輕炎癥反應。

本研究首次探討TFDG對IL-1β體外誘導大鼠軟骨細胞炎性損傷的保護作用。TFDG預干擾明顯改善OA軟骨細胞形態，有利于軟骨細胞維持良好的生物學特征；上調軟骨細胞分子標志物Col II基因表達，促進OA軟骨細胞的修復；下調促炎細胞因子IL-1β和IL-6 mRNA的表達及分泌，表現出明顯的抗炎活性；抑制COX-2蛋白量表達，減少炎性介質產物的合成。綜上所述，TFDG對受損的OA軟骨細胞具有一定的保護作用，可以有效調控骨關節炎，促進關節軟骨修復，在炎癥相關慢性關節疾病的研究、預防及治療中具有科研前景。

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Research on the Protective Effects of TFDG on IL-1β-induced Inflammatory Injury in Rat Chondrocytes in Vitro

ZHOU Ying1, HUANG Qian2, ZHANG Tian1, CHEN Ping1*
1. Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

The chondrocytes were isolated and harvested from knee articular surface of male Sprague-Dawley rats, which were identified by toluidine blue and type II collagen immunofluorescence staining. To investigate potential protective effects of theaflavin-3,3′-digallate (TFDG) on IL-1β-induced inflammatory injury in rat chondrocytesin vitro, a model of osteoarthritis was established through stimulating rat chondrocytes with IL-1β. Inverted phase contrast microscopy showed TFDG treatment significantly improved osteoarthritis chondrocytes morphology. Real-time PCR results showed that TFDG treatment not only up-regulated chondrocyte marker Col II mRNA expression, but also down-regulated pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 mRNA expression. ELISA analysis further confirmed TFDG treatment significantly decreased the secretion of inflammatory factors. Western blot results showed that TFDG treatment significantly inhibited the inflammation-related enzyme COX-2 expression. Taken together, these results indicate that TFDG has a preventive effect on IL-1β-induced inflammatory injury in rat chondrocytesin vitroby reducing inflammatory reaction.

TFDG, osteoarthritis, chondrocytes, inflammation

Q946.84+1；R681.3

A

1000-369X(2017)03-290-09

2016-10-12

2017-01-05

國家茶葉產業體系（CARS-23）、國家自然科學基金（31200521）、高等學校博士學科點專項科研基金（20120101120112）

周盈，女，碩士研究生，主要從事茶葉藥理功能和茶葉品質鑒定研究，vaelailai@zju.edu.cn。*通訊作者：pingchen@zju.edu.cn