霉菌侵染黑毛茶的顯微觀察

胥偉，趙仁亮，姜依何，吳丹，朱旗

1. 湖南農業大學園藝園林學院茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

霉菌侵染黑毛茶的顯微觀察

胥偉，趙仁亮，姜依何，吳丹，朱旗*

1. 湖南農業大學園藝園林學院茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

通過蘇精-伊紅染色法、苯胺藍染色法結合掃描電子顯微鏡，觀察了人工促霉條件下霉菌侵染黑毛茶的過程。經觀察發現，黑毛茶葉片內部存在空腔結構，葉肉細胞結構破壞嚴重，一定的溫、濕度條件下，霉菌孢子在茶葉表面萌發形成菌絲，由茶葉表面破損部位進入葉片內部，經葉內空腔結構生長至葉片組織各部位。上述結果為研究霉菌侵染黑毛茶的機制提供了相關依據。

黑毛茶；霉菌；侵染；顯微觀察

黑茶是我國六大茶類之一。茶樹鮮葉經殺青、揉捻、渥堆、干燥等工序制得黑毛茶[1]。其中渥堆是黑毛茶生產的關鍵工序[2]，在渥堆過程中，受濕熱和微生物[3-8]的共同作用，茶葉的物質發生一系列轉化，形成了黑毛茶獨有的品質特征。由于原料采摘比較粗老，加工成的黑毛茶需在庫房中存放1～2年才能進行精制，通過精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時，銷售后的成品黑茶，民間也有通過存放以改善其口感粗澀的習俗。但在黑毛茶倉儲或成品黑茶自然存放過程中，由于環境條件的變化，特別是在南方的梅雨季節，茶葉表面極易長霉菌，輕者茶葉會有風霉味，重者會使茶葉失去飲用價值，甚至產生安全問題。為了解黑茶霉變的發生規律，以及對茶葉品質的影響，本研究人工設定環境溫、濕度，以促使霉菌在黑毛茶上生長，通過染色法和掃描電鏡法觀察霉菌菌絲在劣變黑毛茶表面及內部的生長規律，為研究霉菌導致黑毛茶生霉劣變的發生規律提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖南內銷黑毛茶；二甲苯、乙醇（國藥控股上海生物醫藥有限公司）；石蠟、中性樹膠（Sigma-aldrich Co. Ltd.）；PBS（7.2-7.6）、蘇木素、伊紅、苯胺藍（江蘇維爾生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

TS-92搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C恒溫箱（北京市六一儀器廠）；美的微波爐，MM721AAU-PW；M199切片刀（德國徠卡顯微系統有限公司）；YD-315切片機（金華市益迪醫療設備有限公司）；BMJ-A包埋機（常州市中威電子儀器有限公司）；榮事達冰箱，BCD-245F；E-201-C精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；BA210T顯微鏡（Motic (Xiamen)Electric Group Co. ,Ltd.）；DY89-1蓋玻片、AY89-2載玻片（海門市遠泰實驗器材廠）；PYX-800Q-B人工氣候箱（廣東韶關科力實驗儀器有限公司）；KL300 LED體式顯微鏡（德國徠卡顯微系統有限公司）；JSM-6380LV掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社(JEOL)）。

1.3 方法

稱取1.0 kg黑毛茶茶樣盛于白瓷盤中，置于人工氣候室，并設定培養條件：溫度25℃，相對濕度90%。人工培養第4天可見茶葉表面開始出現菌絲，待茶葉培養第12天時進行體式顯微拍照，觀察茶葉表面霉菌生長情況，待培養18天霉菌生長密集時選取有代表性的茶樣進行石蠟包埋制片。

黑毛茶葉片組織形態學觀察材料選用未處理黑毛茶，采用蘇精-伊紅染色法染色觀察。石蠟包埋切片后60℃烤片1～2 h，將切片置于二甲苯中10 min，2次，之后在100%乙醇中放置10 min，然后依次在95%、85%和75%的乙醇中分別放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min，蘇木素染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍，伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗，95%乙醇脫水5 min，100%乙醇脫水5 min，取出后置于二甲苯中10 min，觀察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

霉菌侵染組織形態學觀察材料選用促霉培養18 d的黑毛茶，采用苯胺藍染色法染色觀察。石蠟包埋脫水方法同蘇精-伊紅染色法，再用蒸餾水浸洗5 min，苯胺藍染3 h，自來水沖洗，蒸餾水沖洗，直接將片子烤干，取出后置于二甲苯中10 min，觀察切片透明度，再次置于二甲苯中10 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

掃描電鏡觀察材料選用促霉培養18 d的黑毛茶，方法同文獻[9]。

2 結果與分析

2.1 黑毛茶形態學顯微觀察

黑毛茶葉片維管束結構完整，木質部導管排列緊密，微管形成層及韌皮部結構清晰。葉肉細胞破壞嚴重，根據伊紅染色深淺可區分柵欄組織和海綿組織。表皮結構破壞嚴重，部分表皮呈隆起狀，下表皮可見氣孔。葉片組織存在較多空腔狀結構，負責葉片有機物質運輸的篩管分子可見。部分細胞壁特異性增厚，形成石細胞。大部分細胞壁結構完整，而原生質體結構破壞嚴重（圖1）。該部分鏡檢結果與何國藩等[10]關于普洱茶組織切片的研究結論相似。

2.2 霉菌侵染黑毛茶顯微觀察

圖1 黑毛茶形態學顯微觀察Fig. 1 The microscopic observations of the morphological changes in raw dark tea

在25℃，相對濕度90%的培養條件下，霉菌可在茶葉表面生長，孢囊梗直立于茶葉表面，孢子囊清晰可見。依據苯胺藍可將真菌原生質體染成藍色的特性[11]，觀察了霉菌在葉片組織內的生長狀態。霉菌菌絲存在于葉片表面、內部空腔及胞間層，菌絲生長不存在特定徑向性。部分切片可觀察到菌絲形成側面突起，及特異化菌絲——吸器，吸器為霉菌菌絲吸收營養的主要器官，其主要出現于本研究材料細胞原生質體濃縮聚集的部位。觀察到菌絲間有接觸融合，考慮存在葉片組織內有性生殖的可能（圖2）。

2.3 霉菌侵染黑毛茶掃描電鏡觀察

霉菌菌絲交織分布于黑毛茶表面，存在狀態不一。氣孔結構完整，部分處于開放狀態。部分菌絲細胞壁坍塌老化。孢子囊結構完整，部分孢子囊已成熟并釋放孢子，孢子類型不一。霉菌菌絲通過葉面破損部位侵入葉片組織，與苯胺藍染色觀察到的霉菌菌絲在黑毛茶葉片內空腔部位生長的現象匹配。觀察到霉菌菌絲跨過開放氣孔卻未能經其進入葉片細胞內部，考慮氣孔能阻礙外來物種侵入，其機理有待于進一步研究。葉片切面顯示細胞結構破壞嚴重，細胞顯微結構無法進行觀察，與染色法觀察到的現象匹配（圖3）。

3 討論

通過掃描電鏡圖片的孢子囊及孢子形態可觀察出，人工促霉條件下導致黑毛茶生霉劣變的霉菌類型主要為曲霉屬（Aspergillus）真菌。本研究采用蘇精-伊紅染色法、苯胺藍染色法和掃描電鏡法觀察了黑毛茶葉片組織學形態及在高濕條件下霉菌在生霉劣變黑毛茶表面及內部的生長規律。

圖2 霉菌侵染黑毛茶顯微觀察Fig. 2 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea

圖3 霉菌侵染黑毛茶掃描電鏡觀察Fig. 3 The microscopic observations of infection of mycete in raw dark tea by SEM

研究發現，黑毛茶經殺青、揉捻、渥堆及干燥工序后其葉片組織形態發生改變。葉片表皮破壞嚴重，呈斷裂及隆起狀，柵欄組織及海綿組織細胞松散，原生質體濃縮成團，部分厚壁細胞、石細胞及維管束細胞形態完整。茶葉加工的揉捻工藝是使茶樹葉片在揉桶及揉盤棱骨的相互作用下圍繞葉脈卷緊的過程[12]。葉肉細胞受到擠壓撕裂，其細胞破碎度需要達到工藝要求。因此，茶樹葉片在經過干燥工序后必然表現出原生質體濃縮成團、維管束細胞形態完整及葉片組織出現空腔狀的結果，這為霉菌侵染提供了基質基礎。

霉菌菌絲通過葉面破損部位沿葉內空腔生長，菌絲或假根特異化形成吸器寄生于原生質體及細胞壁，茶葉表面菌絲成熟形成孢囊梗，孢囊梗頂端特異化形成孢子囊。食品吸濕曲線模型GAB理論[13-14]認為，當平衡含水率為單分子層結合在基質之上時，該部分水分結合牢固，水分不被微生物利用[15]。高濕條件下，茶葉基質親水性物質結合空氣中的自由水，當水活度升高到一定程度，微生物便可利用而促進其生長，從而導致食品生霉劣變。宏蛋白組學研究表明，微生物存在利用植物細胞壁的內切1,4-β木聚糖酶、果膠酸裂解酶、果膠酯酶、α-葡萄糖醛酸苷酶[7]等。高濕條件下，經人工培養，霉菌孢子萌發生長，通過胞外酶系為霉菌提供營養。葉片破損部位及空腔結構便成了微生物最有可能利用自由水的部位。由此，室溫條件下，空氣濕度是未密封包裝茶葉生霉劣變的限制因子。由于研究手段和實驗處理設計的限制，未能觀察到霉菌菌絲在黑毛茶葉片細胞內部生長的精細結構，有待進一步研究。

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Microscopic Observations of the Infection of Mycete in Raw Dark Tea

XU Wei, ZHAO Renliang, JIANG Yihe, WU Dan, ZHU Qi*
1. Key laboratory of Tea Science of Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In this study, the process of mycete infection in raw dark tea under the condition of artificial mildew was observed by a combination of hematoxylin, eosin, aniline blue staining and scanning electron microscopy analysis. It was found that there was serious structural damages in mesophyll cells of raw dark tea. Under controlled temperature and humidity conditions, mycete spores were grown into mycelium on the surface of tea, crossed the damaged parts and the cavity structures and finally reached the whole leaves. These results provided a basis for understanding relative mechanism involved in mycete infection in raw dark tea.

raw dark tea, mycete, infection, microscopic observation

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）03-237-06

2017-01-29

：2017-03-05

國家自然科學基金（31571802）、湖南省教育廳重點項目（14A066）、湖南省研究生科研創新項目（CX2016B283）

胥偉，男，博士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分化學研究。*通訊作者：1965994459@qq.com