用于測定黑茶中鉛的熒光增強化學傳感器

龍立平，孟維，王姣亮，謝丹，賀國文，肖谷清

湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413049

用于測定黑茶中鉛的熒光增強化學傳感器

龍立平，孟維，王姣亮，謝丹，賀國文，肖谷清

湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413049

鉛(Ⅱ)對固定在增塑的聚氯乙烯（PVC）敏感膜中的紅霉素A有可逆熒光增強作用，據此研制了測定鉛（Ⅱ）的熒光化學傳感器。該傳感膜的組成為：50.0 mg PVC、100.0 mg鄰苯二甲酸二異辛酯和2.94 mg紅霉素A。該傳感器在pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，測定鉛（Ⅱ）的動力學范圍為4.00～6.00 mmol·L-1，檢出限為0.10 μmol·L-1，響應時間小于50 s。該傳感器具有良好的重現性、可逆性和選擇性，除Cr2O72-和MnO4-外，常見陰離子和陽離子不干擾測定。該傳感器應用于黑茶水樣中鉛（Ⅱ）含量的測定，結果與GB 5009.12—2010法一致。

光化學傳感器；熒光增強；鉛(Ⅱ)；紅霉素A

黑茶是中國六大茶類之一，更是西北少數民族不可缺少的日常飲品。由于茶園土壤、水質及汽車尾氣等多種原因導致茶葉中含有一定量的鉛。飲茶成為人體攝入鉛的途徑之一。鉛是人體非必需的一種累積性極強的有害元素，被列為茶葉衛生檢驗項目之一。茶葉國家進出口行業標準[1]中鉛含量小于2 mg·kg-1。因此，在茶葉生產、銷售過程中建立靈敏的鉛含量檢測方法具有重要意義。國家標準規定食品中鉛的測定方法通常采用原子光譜法、高效液相色譜法和二硫腙比色法等[2]，但這些方法具有樣品用量大、預處理復雜、檢測慢、檢測價格高、穩定性差及不能在線檢測等不足。熒光傳感器具有靈敏度高、操作簡單和可在線檢測等優點[3]，本課題組已開發出卟啉類鉛離子熒光探針[4]，但多是基于熒光熄滅，鮮有熒光增強的報道[5]。紅霉素A是一個含14元環內酯的大環內酯類抗生素，目前研究工作大多集中在合成、測定含量及其藥理功能方面[6]，還未有運用紅霉素A作熒光探針的報道。本文將紅霉素A制成PVC敏感膜，研究了該敏感膜與鉛的反應并制成了測定鉛的光化學傳感器。該傳感器用于黑茶粉末及其浸取液中鉛含量的測定，測得鉛的回收率為96.4%～108.5%。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

F-4600型熒光光度計（日本日立公司）、FC104電子天平（上海精密儀器有限公司）、PHS-3C精密pH計（江蘇江分電分析儀器有限公司）。

紅霉素A（標準品，歐洲進口）、高密度聚四氟乙烯（PVC，湖南株洲）、鄰苯二甲酸二異辛酯（DIOP）、四氫呋喃（THF）和黑茶（大梅龍泉散茶，湖南城市學院黑茶研發科技有限公司）等。0.5 mol的Tris溶于1 000 mL水中，然后用0.5 mol·L-1HCl或NaOH調節pH制成緩沖溶液。

1.00 ×10-2mol·L-1Pb2+標準儲備液：取高純鉛棒，刮去表面氧化層，削成小片狀，稱取1.0360 g，置于150 mL燒杯中，加入50 mL 6 mol·L-1的HNO3溶解后，移入500 mL容量瓶中，配成1.00×10-2mol·L-1的儲備液，于棕色瓶中低溫保存，使用時用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成不同濃度的Pb2+工作液。

實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑和溶劑均為分析純且無熒光，使用前未經其他純化處理，使用時用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成。實驗溫度為（20±1）℃。

1.2 敏感膜制備

取50.0 mg PVC、100.0 mg DIOP和2.94 mg（2.0 μmol）的紅霉素A溶于2.0 mL新蒸THF中，配成制膜液。將直徑為35 mm的潔凈石英玻片放在自制的制膜裝置上，取0.2 mL制膜液旋轉制膜，制得1層厚度約4.0 μm的PVC膜[7]，放置1 min后即可使用，所制得的膜不用時置于陰處干燥保存。

1.3 實驗方法

將1片附有敏感膜的石英玻片和1塊大小相同深色PVC板裝入一自制流通測量池中[8]，連接蠕動泵，再將測量池以特定位置固定于樣品室，選擇激發/發射狹縫寬度為5.0 nm/10 nm，最大激發/發射波長為358 nm/409 nm，事先泵入pH=8.0的Tris/HCl緩沖溶液浸泡敏感膜，直至熒光強度穩定不變，再注入樣品溶液測定敏感膜熒光強度。完成1次樣品測量后，泵入緩沖溶液沖洗敏感膜，直至熒光信號恢復到穩定的最小值后再進行另一樣品測定。

1.4 樣品制備

黑茶浸取樣液1#的制備：準稱黑茶樣品10.0 g（每個樣品平行稱取5份）置于燒杯中，加入50 mL新煮的沸水，浸泡5 min后用傾瀉法濾出，濾液移至250 mL容量瓶中。再向燒杯中加入50 mL沸水，按上述同樣方法重復4次，濾液全移至250 mL容量瓶中，用水定容。

黑茶粉末樣液2#的制備：按國標方法[2]進行樣品處理。準確稱取已粉碎的黑茶樣品10.0 g（每個樣品平行稱取5份）于250 mL凱氏定氮瓶中，加入15 mL硝酸，加熱，待作用緩和后冷卻，沿瓶壁加入5 mL硫酸，再加熱，緩緩加硝酸至有機質完全分解。所得溶液為淺黃色，冷卻。加30 mL水煮沸，除去殘余硝酸至產生白煙為止。冷卻后的溶液移入250 mL容量瓶中。取與消化試樣相同量的硝酸和硫酸，按同樣方法做空白實驗。

2 結果與討論

2.1 紅霉素A對Pb2+識別的競爭性實驗

向含紅霉素A的敏感膜中分別加入濃度為1.00×10-2mol·L-1的各金屬離子的硝酸鹽后，測定其在409 nm處的熒光強度，結果如圖1。從圖中可以看出，加入Pb2+后，敏感膜的熒光強度增強了3倍，而其他金屬離子的加入對敏感膜的熒光強度影響不大。同樣，加入含K+為1.00×10-2mol·L-1的NO3-、AC-鹽后，敏感膜的熒光強度無明顯變化，由此說明紅霉素A敏感膜可作為潛在的Pb2+傳感器。

2.2 敏感膜對Pb2+的熒光響應與測量原理

紅霉素A為大環內酯類抗生素，結構中富含電子，具有弱的熒光，可以提供電子與Pb2+形成絡合物。圖2為敏感膜與不同濃度的Pb2+接觸后的熒光發射光譜。從圖中可以看出，隨著Pb2+濃度增加，敏感膜中紅霉素A的熒光強度增大，且峰形和峰位均無變化。由此可見，Pb2+與紅霉素A間的結合是非共價鍵結合[9]。

將紅霉素A固定于增塑的PVC膜中，Pb2+能分別從水相進入膜相，并與膜相中的紅霉素A生成配合物，按照與文獻[10]相似的方法，則下式成立：

α為膜相中游離的紅霉素A濃度與其總濃度之比，同時α亦可用檢測到的熒光信號的熒光強度表示：

式（1）中cA、[Pb2+] 分別為紅霉素A在膜中的總濃度及Pb2+在水相中的總濃度，m、n為Pb2+與膜相中紅霉素A的絡合比，當m、n一定時，溶液中待測[Pb2+]與α有確定的函數關系；式（2）中F0、Fs分別為敏感膜中紅霉素A全部以游離態存在和以配合物形式存在時的熒光強度。式（1）、（2）可作為本文研制熒光光化學傳感器測量Pb2+的定量依據。

圖2 PVC敏感膜與不同濃度的Pb2+溶液接觸后的熒光發射光譜（λex=358 nm）Fig. 2 Fluorescence emission spectra of sensitive PVC membrane contacted with different concentration of Pb2+(λex=358 nm)

根據式（1）擬合實驗數據，得到紅霉素A與不同濃度的Pb2+接觸的熒光響應值α與的關系如圖3所示。由圖可知，當配合比為m∶n=2∶1時，實驗點能很好地與理論曲線擬合，所得平衡常數K=7.0×108，這也進一步從實驗證明Pb2+與紅霉素A之間的組成比為2∶1，此曲線（a）可作為測定Pb2+濃度的校準曲線。

2.3 實驗條件優化

2.3.1 敏感膜組成的選擇

敏感膜中紅霉素A的濃度影響敏感膜對Pb2+的熒光響應。圖4為紅霉素A不同濃度的敏感膜對測定Pb2+的熒光響應情況。設F0為敏感膜與空白緩沖溶液接觸時的熒光強度，F為不同濃度的紅霉素A敏感膜作用于10.00 μmol·L-1的Pb2+溶液時的熒光強度。從圖中可知，當敏感膜中紅霉素A濃度增加時，F/F0隨之增加。但當紅霉素A濃度高于2.0 μmol·L-1時，其F/F0反而降低。故本實驗中紅霉素A最佳濃度選擇為2.0 μmol·L-1，即1.92%。

2.3.2 pH的影響

因為紅霉素在酸性和堿性條件下都容易發生降解[11]。紅霉素A在膜相溶液中存在游離分子態和離子態的解離平衡。當pH＜7時，主要以離子態形式存在，隨著pH值升高，膜相溶液中主要以游離分子態形式存在。圖5表示pH對相對熒光強度的影響。從圖中可知，在pH 6.8～8.9范圍內，相對熒光強度F/F0穩定且較大，故可選用pH=8.0為最佳pH條件。

2.3.3 敏感膜響應特性

圖3 實驗數據點擬合圖Fig. 3 Plots of lgc vsa fitted Eq. (1) exp. data line

圖4 紅霉素A用量的影響Fig. 4 The dosage effects of erythromycin A on fluorescence intensity

圖5 pH對配合物相對熒光強度的影響Fig. 5 Effects of pH on fluorescence intensity on complex

圖6為最佳敏感膜分別交替測定空白緩沖溶液、20.00 μmol·L-1Pb2+溶液和30.00 μmol·L-1Pb2+溶液的熒光強度對時間的變化關系圖。從圖中可以看出，當Pb2+濃度為20.00 μmol·L-1時，熒光強度平均為1208.2±8.96（n=5）；當Pb2+濃度為30.00 μmol·L-1時，為1876.9±7.39（n=5）；pH=8.0的Tris/HCl空白緩沖溶液的熒光強度平均為815.6±3.95（n=6），表明該傳感器具有良好的重現性和可逆性。由圖中還可以看出，濃度由高到低或從低到高響應時間t95（即熒光強度信號變化95%所需的時間）均小于50 s。

用最佳敏感膜測定濃度為20.00 μmol·L-1的Pb2+溶液，每30 min測定1次熒光強度，共進行10 h，所測得平均熒光強度為1207.2±10.57（n=21）。該敏感膜不用時干放保存，15 d后測上述同一溶液，測得平均熒光強度為1201.3±11.22（n=21）。由此表明，該敏感膜在一定時間內測試Pb2+溶液具有較好的穩定性。

圖6 PVC敏感膜交替測定不同濃度Pb2+溶液的熒光強度對時間的響應Fig. 6 The time course response of fluorescence intensity of PVC membrane to different concentration of Pb2+solutions

2.3.4 標準曲線、靈敏度和選擇性

圖3內插圖即為傳感器定量測定Pb2+的標準曲線，其線性方程為：

α=－2.584lgc－0.694，r=0.9956

其中c為Pb2+的濃度，r為相關系數。根據0.05≤(1?α)≤0.95[12]，其測定Pb2+的動力學范圍為4.00～6.00 mmol·L-1，根據3S0/K（S0為空白測定值的標準偏差，K為標準曲線的斜率），檢出限為0.10 μmol·L-1。

按1.3實驗方法測定10.00 μmol·L-1Pb2+中不加或加單個常見的共存離子實驗，并以熒光強度變化的相對誤差±5%來評價對Pb2+測定的影響。可允許的共存物質倍率為：Na+、K+、NH4+，1 000倍；Cd2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、 Ba2+，500倍；Ni2+、Fe2+，100倍；Cr3+，10倍；Al3+，1.0倍；Fe3+、Mn7+、Cr6+，0.01倍。但在茶葉等食品中Mn7+和Cr6+濃度極小。如當有大量Fe3+干擾時，可加入檸檬酸掩蔽Fe3+再進行樣品測定。

3 樣品分析及回收率測定

按1.3實驗方法取上述1.4樣品制備的樣品，用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成后分別測定其熒光強度并進行加標實驗，按標準曲線進行定量，結果見表1。由表中可知，該方法與GB 5009.12—2010（AAS法）測定的結果無顯著差異，測得Pb2+的回收率為96.4%～108.5%。

表1 樣品測定結果（n=5）Table 1 Determination results of the samples (n=5)

4 結論

紅霉素A是一類抗生素，在醫用臨床領域應用廣泛，本研究用紅霉素A的微弱熒光作為熒光探針，在分析檢測中擴展了它的應用。本研究發現紅霉素A在PVC膜相中與Pb2+反應，通過非共價鍵合作用生成2∶1的絡合物，該絡合物能顯著增強其熒光。據此，用以檢測溶液中Pb2+的含量，具有較高的靈敏度和良好的選擇性，同時，所制光傳感器還可以實現在線檢測。黑茶因其原料與其他茶類相比較粗老，故其鉛含量是產品生產檢測中的一個重要指標。本方法樣品處理簡單，為茶葉企業在茶葉加工生產中鉛的監控提供了在線監測的可能。

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A Sensing PVC Membrane Based on Fluorescence Enhancement of Erythromycin A for Lead (Ⅱ) Detection in FU Tea

LONG Liping, MENG Wei, WANG Jiaoliang, XIE Dan, HE Guowen, XIAO Guqing
College of Chemistry & Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413049, China

An optical chemical sensing membrane based on reversible fluorescence enhancement of Erythromycin A immobilized in a plasticized poly (vinyl chloride) (PVC) membrane for Lead (Ⅱ) detection was developed. The membrane of the sensor consists of 50 mg of PVC, 100 mg of Di (2-ethylhexyl) phthalate and 2.94 mg of Erythromycin A. The maximum response of the sensing membrane to Lead (Ⅱ) was obtained in Tris/HCl buffer solution ( pH 8.0). Under optimal conditions, the proposed sensor responded linearly to Lead (Ⅱ) in the range of 4.00-6.00 mmol/L and had a detection limit of 0.10 μmol·L-1. The response time of the sensor was less than 50 s. In addition to the high reproducibility and reversibility of the fluorescence signal, the sensor also exhibited good selectivity. Except for Cr2O72-and MnO4-, it was not interfered by other common metal ions and anions. It was applied for the determination of Lead(Ⅱ) in a sample of FU Tea, which offered a satisfactory result.

optical chemical sensor, fluorescence enhancement, lead(Ⅱ), erythromycin A

TS272.5+4；P618.42

A

1000-369X(2017)03-273-07

2017-01-09

：2017-03-21

國家自然科學基金資助項目（21545003、21502048），湖南省自然科學基金資助項目（2015JJ2023、13JJ3117），湖南省高校科技創新團隊支持計劃資助項目（湘教通〔2014〕207號），湖南省黑茶金花重點實驗室資助項目（湘科規財〔2016〕8號）

龍立平，男，教授，主要從事光化學傳感器的研制與應用研究，E-mail：llping401@163.com