熒光定量PCR儀（ABI7500）操作規程及日常維護

曹蕾　馬揚光　施小明

【摘 要】 介紹了熒光定量PCR儀（ABI7500）操作規程，總結了其日常維護和注意事項，為其使用提供指導。

【關鍵詞】 熒光定量PCR儀 操作規程 維護

熒光定量PCR儀將PCR熱循環，熒光檢測和各種應用分析軟件結合在一起，可以動態觀察PCR每一循環各反應管中PCR擴增產物逐漸增加的情況。

1 原理介紹

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[1]。

熒光染料法：熒光染料能特異性摻人DNA雙鏈，發出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物增加完全同步[1]。

熒光探針法：探針的5 端標記熒光報告基團 （reporter R） 3 端標記淬滅基團（quencher Q），探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步[1] [2]。

通常，熒光擴增曲線可分為三個階段，即熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此可以在該階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較，在指數期需要設定一個熒光信號的閾值。熒光信號由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數稱為ct值。模板的ct值與其起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，則ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品及其相應的ct值可繪制出標準曲線，測得未知樣品的Ct值后，根據標準曲線便可準確計算出該樣品的起始拷貝數[3]。

2 操作規程

2.1 開機

2.1.1 依次打開電腦顯示器和電腦主機的電源開關，進入Windows界面。

2.1.2 接著打開AB7500儀器電源開關，預熱10分鐘。

2.1.3 點擊SDS軟件。

2.2 檢測

2.2.1 選擇File-New-新建，在New Document Wizard窗口中，從Assay下拉列表中選擇反應類型：相對定量，絕對定量，等位基因鑒別或陽性陰性實驗，從Container下拉列表中選擇反應板類型，在Default Plate Name中輸入反應板文件名，點擊Next，選擇需要添加到反應板文件的探針，點擊Next，為每個孔指定探針和任務，單擊Finish。

2.2.2 在Well Inspector-View-Well Inspector中輸入樣品名。

2.2.3 運行相應的反應類型程序，選擇Instrument設定PCR條件。

2.2.4 點擊Save下拉菜單下的Save As，輸入文件名，點擊save，關閉設置界面。

2.2.5 按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測反應板放入檢測孔位，再次按壓托盤使其滑入儀器，點擊Start開始檢測。

2.3 結果分析

PCR反應結束后自動保存結果，對擴增曲線進行分析，選擇Analysis-Analysis Settings 選擇Auto Ct，軟件自動為每個反應空生成基線和閾值，也可根據分析后圖像調節Baseline的Start值、End值，Threshold值，點擊Analyze進行再次分析。

2.4 關機

實驗結束后取出反應管（切勿打開管蓋），順序關閉AB7500軟件、定量PCR儀電源，關閉電腦

3 日常清潔維護[4]

3.1 每周用無絨布塊蘸取75%酒精清潔儀器的表面。

3.2 每周使用75%酒精浸泡反應管托架（晾干后放回儀器內）。

3.3 每月執行一次背景校準

3.4 每半年檢查燈具狀態。在7500 Software中，選擇Instrument-Lamp Status/Replacement以確定鹵素燈的狀態：Condition顯示 Good 表示燈具工作良好，不需更換鹵素燈；顯示Failed表示鹵素燈已壞，需更換； Change Soon表示燈具使用超過2000小時，建議將更換。

3.5在PCR儀運行之前或期間，7500 Software可能顯示警告，按警告要求進行目標區（ROI）校正、背景校準、光學校準、染料校準、RNase P儀器驗證試驗等。

參考文獻

[1] 鐘江華，張光萍，柳小英.實時熒光定量PCR技術的研究進展與應用[J].氨基酸和生物資源，2011，33（2）：68～72.

[2] 蘭靜，李秋根.實時熒光定量PCR技術理論研究及其在醫學方面的應用[J].南昌大學學報（醫學版），2011，51（10）：97～100.

[3] 王志平.熒光定量PCR技術的原理與應用[J].渭南師范學院學報，2012，27（10）：61～64.

[4] 魏建新. ABI7500 型熒光定量PCR儀的使用維護及故障排除[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2015，25（21）：3780～3781.