循環微小RNA對冠心病患者的診斷價值

衣紹蕊，孫經武，王秀花，史孟松，曲輔政，周紅霞，劉平平，路新磊

(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺264100)

循環微小RNA對冠心病患者的診斷價值

衣紹蕊，孫經武，王秀花，史孟松，曲輔政，周紅霞，劉平平，路新磊

(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺264100)

目的 探討循環中微小RNA(miRNA)作為非侵入性生物學標志物對冠心病(CAD)患者的診斷價值。方法 采用隨機、開放、對照的方法連續選取CAD患者99例[包括穩定型心絞痛(SAP)組33例、UA組66例]和非CAD患者30例(非CAD組)。分離患者RNA，應用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測三組循環中miRNA(miR-149、miR-424和miR-765)表達水平。結果 與非CAD組比較，SAP組、UA組血漿miR-149、 miR-424水平降低，miR-765水平升高，差異有統計學意義(P均<0.05)。SAP組與UA組比較，血漿miR-765水平有統計學差異(P均<0.05)。血漿miR-149、miR-424和miR-765水平鑒別診斷SAP、UA和非CAD患者的敏感性、特異性較高。結論 循環中miR-149、miR-424、miR-765可能成為診斷CAD患者的一種新型非侵入性生物學標志物。

穩定型心絞痛；不穩定型心絞痛；非冠狀動脈疾病；循環微小RNA

微小RNA(miRNA)是一種較小(僅22個核苷酸長)的內生性、單鏈非編碼RNA，通過與3′非編碼區的結合，可減少或抑制信使RNA翻譯，調控靶基因的表達[1]。有研究證實，miRNA在心血管內皮功能異常、炎癥、細胞凋亡、新生血管形成、動脈粥樣硬化和新生內膜增生或再狹窄等病理生理過程中發揮重要作用[2]。血漿中的miRNA稱為循環miRNA，在小囊泡中內化及形成蛋白miRNA復合物能抵抗血漿中RNA酶活性[3,4]。最近有研究證實，循環miRNA的表達水平在不穩定型心絞痛(UA)、急性心肌梗死、心力衰竭、心房纖顫、卒中和腫瘤患者中發生顯著改變[5,6]。某些循環miRNA如miR-423-5p、miR-103、miR-142-3p、miR-30b和miR-342-3p已被公認為與心衰高度相關[7]。但目前仍沒有關于循環miRNA作為診斷冠心病(CAD)患者的新型生物學標志物的報道。本研究檢測CAD患者血漿中miR-149、miR-424、miR-765的水平變化，以判斷其對CAD的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 采用隨機、開放、對照的方法連續選取本院2015年6月～2016年6月就診的CAD患者99例[包括穩定型心絞痛(SAP)組33例、UA組66例]和非CAD患者30例(非CAD組)。根據AHA/ACCCAD分類標準冠狀動脈造影檢查至少1條主要冠脈狹窄≥50%確診為CAD，并按照ACC/AHA指南定義SAP和UA[8]。99例CAD排除以下患者：年齡>80歲、既往心肌梗死病史、肌鈣蛋白I或CK-Mb升高、左室射血分數(LVEF)≤45%、充血性心力衰竭、心律失常、嚴重的肝腎功能異常、腎臟替代治療、慢性炎癥或惡性疾病、近期曾行重大手術者。非CAD患者根據12導聯心電圖、超聲心動圖檢查排除CAD及其他相關疾病，無卒中史、無急性或慢性肝腎疾病病史、入選前1個月無住院史。三組患者在年齡、性別、吸煙史、血壓、血糖、血脂、心功能、肝腎功能等方面差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 血液樣本采集 采集CAD和非CAD患者肘前靜脈血5 mL，30 min內進行兩次離心處理。初次在4 ℃條件下以1 500 r/min離心15 min，收集上清液；在4 ℃條件下以14 000 r/min再次離心15 min，得到純血漿。最后將血漿在無RNA酶的試管中-80 ℃條件下保存。

1.3 分離RNA 在250 μL血漿中加入750 μL RNA提取劑，混合均勻后室溫下孵育5 min，然后加入200 μL三氯甲烷室溫下孵育3 min。4 ℃以12 000 r/min離心15 min。收集上層溶液，與500 μL 100%異丙醇混合，-20 ℃保存過夜。然后將樣本用離心機在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，使RNA沉淀。用80%乙醇500 μL清洗RNA樣本2次，然后在4 ℃下以7 500 r/min離心10 min。移除上清液，將沉淀在室溫下干燥5 min。用無RNA酶的清水30 μL 稀釋RNA樣本，然后在4℃下孵育8 h。最后，用分光光度計測量2 μL 樣本中RNA濃度，將RNA樣本保存在-80 ℃下供以后使用。

1.4 miRNA檢測分析 應用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miRNA的表達。首先，在42 ℃下按照說明書應用具有反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應的反轉錄試劑盒將4 μL純RNA逆轉錄到互補DNA上30 min。第二，應用互補DNA 2 μL作為qRT-PCR模板。應用雙鏈嵌合熒光染色微小miRNA反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應的反轉錄試劑盒檢測miR-149、miR-424和miR-765表達。選擇miR-156a作為內對照，來自每項研究的每個樣本均應用PCR一式三份進行分析，應用CT比較成像法計算各種miRNA的相對表達水平，以2-ΔCt表示。qRT-PCR 檢測Ct值大于40的樣本被認為不表達。為了降低假陽性率，本研究僅測量比健康對照組平均高2倍的CAD或不穩定型心絞痛患者的miRNA。

切概率法或χ2檢驗；應用ROC分析評估各組循環miRNA診斷準確性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAD患者血漿miRNA的表達 與非CAD組比較，SAP組、UA組血漿miR-149、 miR-424水平降低，miR-765水平升高，差異有統計學意義(P均<0.05)。SAP組與UA組比較，血漿miR-765水平有統計學差異(P均<0.05)。見表1。

表1 三組血漿miRNA的表達水平比較

注：與非CAD組比較，*P<0.05；與UA組比較，△P<0.05。

2.2 血漿miRNA水平對CAD的診斷價值 ROC曲線分析顯示，血漿miR-149，miR-424和miR-765是診斷CAD的生物學標志物。血漿miR-149、miR-424和miR-765水平鑒別診斷SAP、UA和非CAD患者最大臨界點、敏感性、特異性、曲線下面積(AUC)見表2。

表2 三種miRNA鑒別診斷CAD的ROC分析

3 討論

CAD的主要病理基礎是動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是高血脂誘導的動脈壁的慢性炎癥性疾病，主要發生在內皮功能異常致血液層流改變的部位。最新的證據表明，血流狀態改變調控內皮細胞中miRNA的表達[9]。循環miRNA能抵抗血漿RNA酶活性，且其性質非常穩定，最有可能成為診斷CAD的可行性生物學標志物。

研究顯示，5,10-甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)在同型半胱氨酸代謝中發揮關鍵作用。MTHFR功能異常會增加血漿同型半胱氨酸水平，促進內皮功能異常和動脈粥樣硬化形成，其中TNF-α在內皮功能異常發生發展中起到重要作用。人類MTHFR rs4846049(T等位基因)具有多態性的特點，其通過結合修飾miR-149顯著增加中國漢族人口CAD和血脂異常的風險。miR-149能模擬轉染抵消TNF-α誘導的金屬蛋白酶、誘導型一氧化氮合酶和白介素-6的表達，調控TNF-α誘導內皮功能異常[10]。miR-149在心肌梗死3 d后的大鼠心肌中和接受心臟移植患者心梗邊緣區域的心臟組織中的表達顯著下降[11]。本研究發現，與非CAD患者相比，SAP和UA 患者血漿中miR-149水平顯著下降，與上述研究結果相符，提示血漿miR-149可作為早期診斷CAD的靈敏生物學標志物。

血管內皮功能異常會使單核細胞從循環血液中遷移至血管內膜，與激活的內皮細胞結合，隨后分化成巨噬細胞。miR-424促進單核細胞/巨噬細胞分化，參與動脈粥樣硬化形成發展及相關并發癥的形成[12]。Van Rooij[11]研究發現CAD患者血漿miR-424水平顯著下降，與本研究結果一致。此外，Zhao等[13]研究發現在急性缺血性卒中患者血漿中和缺血發生后4 h的大鼠血漿及腦組織中miR-424的表達水平顯著下調。其機制可能為miR-424模擬物過度表達抑制G1/S轉換的主要催化劑(如CDC25A、CCND1和CDK6)抑制小膠質細胞激活，從而減少缺血性腦損傷[13]。在肺動脈高壓患者中由于aplelin多肽和纖維母細胞生長因子2信號通路調節異常，血漿miR-424水平顯著下降[14]。

Redell 等[15]報道，與健康志愿者相比，腦外傷患者血漿miR-765水平顯著升高。血漿miR-765可能通過調控幾種主要的靶基因(如組織缺氧誘導因子-3、NADPH氧化酶、低密度脂蛋白受體相關蛋白6)參與CAD的發病過程。本研究顯示，與非CAD患者相比，SAP和UA患者血漿miR-765水平顯著升高，提示血漿miR-765可能成為早期診斷CAD的非侵入性生物學標志物。

總之，血漿miR-149、miR-424、miR-765可能是診斷CAD患者新的非侵入性生物學標志物。但是，由于本研究是單中心小樣本，該結果的真實性尚需要大型臨床研究進一步證實。

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