miR-497對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

張猛，張銳，楊季紅，譚雨莎，張笑影，賈佳

(河北大學附屬醫院，河北保定071000)

miR-497對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

張猛，張銳，楊季紅，譚雨莎，張笑影，賈佳

(河北大學附屬醫院，河北保定071000)

目的 探討微小RNA-497(miR-497)對肝癌細胞增殖能力、凋亡的影響及機制。方法 RT-PCR觀察肝癌組織和癌旁組織、肝癌細胞和正常肝細胞miR-497的表達差異；轉染肝癌細胞過表達miR-497，MTT法和軟瓊脂集落形成試驗觀察miR-497對肝癌細胞增殖能力的影響，肝癌細胞周期和凋亡采用流式細胞儀檢測，Western blotting法觀察miR-497對肝癌細胞Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)表達的影響。結果 肝癌組織miR-497 表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)；癌細胞miR-497表達水平顯著低于肝細胞(P<0.05)；miR-497過表達組在96 h和120 h肝癌細胞增殖能力顯著低于對照組(P均<0.05)；對照組細胞增殖能力顯著高于miR-497過表達組(P<0.05)；miR-497過表達組早期凋亡細胞數顯著高于對照組(P<0.05)；對照組FADD相對表達量顯著低于miR-497過表達組(P<0.05)。結論 miR-497可抑制肝癌細胞的增殖，促進凋亡，其作用可能與miR-497促進FADD表達有關。

肝腫瘤；微小RNA-497；細胞增殖；Fas相關死亡結構域蛋白

微小RNA(miRNA)是長度約為22 nt的非編碼調控RNA，多數位于基因組中脆弱的位點或與腫瘤相關的區域，參與機體早期發育、細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等過程。針對miRNA與乙肝病毒、丙肝病毒患者相關性的研究日益增多[1]。miR-497位于17號染色體P13.1，與腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病關系密切[2,3]。在前期研究中發現，miR-497可表達于肝癌組織中。2014年1月～2016年1月我們進一步研究了miR-497對肝癌細胞增殖能力、凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞(HepG2)和人正常肝細胞系(L-02細胞)購買于復旦大學肝癌研究所，培養基為10%特級胎牛血清DMEM(高糖)，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。肝細胞癌組織標本來源于本院肝癌患者，均行肝癌根治術，術后經病理檢查；癌旁組織取自距離肝腫瘤2 cm的組織。FBS胎牛血清(美國Gibco公司)，胰酶(美國Invitrogen公司)，EX Taq酶(日本Takara公司)，T4連接酶(日本Takara公司)，TRIzol(日本Takara公司)，細胞轉染試劑 Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)。miRNA 提取試劑盒(美國 Ambion 公司)，Real-time Taqman 探針(美國APPLIED BIOSYSTEMS公司)，Taq Man 逆轉錄試劑盒(美國 APPLIED BIOSYSTEMS 公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT) (美國Amresco公司)，低熔點瓊脂糖(寶泰克生物科技公司)。CO2培養箱(哈爾濱東聯電子技術公司)，Nano Drop 2000C紫外可見分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，Gene Amp 9700基因擴增儀(美國APPLIED BIOSYSTEMS公司)，iMark酶標儀(美國伯樂公司)，凝膠成像儀(美國KODAK公司)。

1.2 肝癌組織和癌旁組織、HepG2、L-02 miR-497表達檢測 采用RT-PCR技術。組織樣本經過液氮研磨，TRIzol法提取總RNA，分光光度計測定RNA質量(OD260/OD280)，瓊脂糖凝膠電泳。HepG2和L-02接種于6孔板，待細胞匯合度達到90%～100%，TRIzol法提取總RNA，分光光度計測定RNA質量(OD260/OD280)。瓊脂糖凝膠電泳，采用試劑盒步驟進行逆轉錄，Taqman探針法檢測miR-497的表達。引物序列：上游引物5′-CGCCGCCCAGTGTTCAGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′;反應體系：taqman Universal Master Mix Ⅱ 5 μL，taqman assay 0.5 μL，cDNA 0.665 μL，Nuclease free water 3.835 μL。95 ℃ 10 min酶激活，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 15 s退火，72 ℃ 15 s延伸，40個循環。用2-△△Ct計算miR-497相對表達量。

1.3 細胞分組及轉染 HepG2接種于24孔板中，待細胞培養至匯合率達到50%進行轉染，1.25 μL 50 nmol miRNA mimics和陰性對照通過Lipofectamine2000(美國英濰捷基公司)進行轉染，轉染后24 h收集細胞進行實驗。轉染陰性細胞為對照組，轉染陽性細胞為過表達組。

1.4 細胞增殖能力檢測 轉染后24 h，將細胞接種到 96孔板中，4×103/孔，每組6個復孔，分別在細胞生長24、48、72、96、120 h，加入20 μL MTT，震蕩均勻，37 ℃孵育4 h，注射器小心吸取上清，加入150 μL DMSO，490 nm測定每孔吸光度。配置 1%的低熔點瓊脂糖，加入等體積20% FBS和0.5%青霉素的DMEM，6孔板每孔加1.5 mL作為底層基質，細胞轉染24 h后，調整至5×104/mL，100 μL細胞與瓊脂糖混合作為上層基質，培養15 d，結晶紫染液進行染色，顯微鏡下觀察結果并拍照。用Image Pro Plus6分析克隆大小和數目，統計直徑大于50 μm的細胞克隆數目。

1.5 細胞周期和凋亡檢測 轉染后24 h，收集細胞，緩沖液清洗細胞3次，Annexin V和PI孵育染色。孵育20 min后，加入200 μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.6 肝癌細胞內Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)表達檢測 采用Western blotting法。轉染后24 h，收集細胞，裂解液裂解細胞，檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺膠電泳，轉移至備好的硝酸纖維素膜上(恒壓100 V，50 min)，奶粉封閉，FADD抗體4 ℃過夜孵育，二抗孵育1 h，加入ECL，并進行顯影觀察。采用Image J軟件進行蛋白相對量計算。

2 結果

2.1 組織和細胞中miR-497表達比較 肝癌組織、癌旁組織中miR-497 相比表達量分別為0.010±0.001、0.021±0.004，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。癌細胞、肝細胞中miR-497相對表達量分別為0.023±0.009、0.055±0.011，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-497過表達對肝癌細胞增殖能力的影響 對照組和過表達組在接種后24、48、72 h肝癌細胞增殖能力均無統計學差異(P均>0.05)，過表達組在96 h和120 h肝癌細胞增殖能力顯著低于對照組(P均< 0.05)。見表1。對照組細胞克隆數目達到(378.5±11.2)個，過表達組(154.7±15.3)個，對照組細胞克隆數目高于過表達組(P<0.05)。

表1 兩組不同時間增殖能力比較(個

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 miR-497對細胞凋亡和細胞周期的影響 過表達組和對照組各細胞周期分布無統計學差異(P>0.05)；過表達組早期凋亡細胞數顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-497對細胞凋亡和細胞周期的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4 miR-497對FADD表達的影響 對照組FADD相對表達量為0.54±0.24，過表達組FADD相對表達量為1.23±0.31，對照組FADD相對表達量低于抑制組(P<0.05)。

3 討論

肝細胞癌是目前最為常見的實體惡性腫瘤之一，亞太地區和非洲地區為其高發地區，我國肝細胞癌發病人數占全球肝細胞癌發病人數的55%。肝癌在早期不易發現，患者發現時多為晚期，生存期一般只有3～16個月，確診時病人常失去接受根治性治療的機會。肝移植和手術切除可使肝細胞癌患者的五年生存率達到 70%。肝癌的危險因素眾多，如丙肝病毒感染、營養缺乏、寄生蟲感染和遺傳等。miRNA在肝癌發病過程中作用尚不明確，但是miRNA參與了乙肝病毒感染過程，miRNA可通過RNA沉默調控乙肝病毒在體內的復制和機體免疫應答，從而導致了肝臟的正常生理活動的異常[4]。

miRNA是長度為20～25個的單鏈小分子 RNA，miRNA通過對基因編碼的翻譯進行控制，實現對調控基因表達功能的控制，miRNA調控作用可見于機體的生長發育、器官形成和細胞增殖等過程[5]。miRNA在腫瘤的發生發展中可能起到原癌或抑癌的作用。miRNA在多種腫瘤中表現出表達紊亂[5]，如食管癌、前列腺癌和甲狀腺癌等。不同的miRNA在腫瘤細胞中表現出不同的行為模式，一般表達上調，一部分表達下調，上調的miRNA可促進癌癥的發生發展，對抑癌基因、抑制細胞分化的基因和抑制細胞調亡的基因具有抑制作用，乳腺癌患者可表達20倍于正常人的miR-195，骨髓瘤中miR-155可促進腫瘤細胞的異常增殖[6]。表達下調的miRNA表現出抑癌基因作用，對于原癌基因具有沉默作用，miR-192可抑制人骨肉瘤細胞的抑制增殖，發揮抗癌功能[7]。

乙型肝炎感染是亞洲肝細胞癌的主要危險因素。乙型肝炎感染過程中，miRNA可調控病毒復制和機體免疫應答，不同種類的miRNA在乙型肝炎感染功能各有不同，比較轉染HBV基因組HepG2 細胞與正常HepG2細胞，11種miRNA表達上調，7 種miRNA表達下調[8]。肝癌中也可檢測到多種miRNA的表達異常，目前研究最為特異的為miR-122，miR-122 在幾乎所有肝癌細胞系中表達下調，肝癌組織中miR-122也低于癌旁組織[9]。miR-21 在肝癌組織中比正常肝組織表達量高 10 倍，miR-21 能抑制 PTEN翻譯，促進癌細胞增殖、轉移[10]。本研究發現，肝癌組織miR-497表達低于癌旁組織，肝癌細胞中低于正常肝細胞，說明miR-497可能和肝癌的發生發展存在一定的關聯。進一步研究中，通過轉染在肝癌細胞中過表達miR-497，MTT實驗和軟瓊脂集落形成實驗均表明miR-497可抑制肝癌細胞的增殖，miR-497對癌細胞的細胞周期無影響，但可誘發其早期凋亡。miR-497是miR15家族中的一員，是一種高度保守的miRNA，miR-497與腫瘤、心血管疾病、神經退行性疾病存在密切關聯。miR-497在乳腺癌中可使癌細胞細胞周期G1期受抑制。結腸直腸癌細胞中能抑制 IGF1-R3UTR的活性,下調IGF1-R。而在腎上腺皮質癌中，miR-497可促進癌細胞的凋亡[11]。細胞凋亡包含多種途徑，而其中有多種蛋白參與其中，如Caspase系列蛋白、Bcl-2系列蛋白和 p53蛋白等[12]。Casapse在某些腫瘤的誘發和發展過程中扮演了重要的角色。凋亡因子FADD可通過調節Caspase蛋白表達誘導細胞的凋亡[13]。本研究結果顯示過表達miR-497后，FADD表達顯著上升，說明miR-497可通過某種機制上調FADD的表達，從而導致肝癌細胞的凋亡。

綜上所述，miR-497可抑制肝癌細胞的增殖，促進凋亡，其作用可能與miR-497促進FADD表達有關。但其具體的作用機制，有待進一步的研究。

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張銳(E-mail：20131321@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.014

R735.7

A

1002-266X(2017)17-0042-03

2016-11-01)