細胞因子誘導殺傷細胞對結腸癌HCT116細胞株的殺傷作用

李智奇，崔勇

(1 廣東醫科大學研究生院，廣東湛江 524000；2 深圳市南山區蛇口人民醫院)

細胞因子誘導殺傷細胞對結腸癌HCT116細胞株的殺傷作用

李智奇1，崔勇2

(1 廣東醫科大學研究生院，廣東湛江 524000；2 深圳市南山區蛇口人民醫院)

目的 探討細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞對結腸癌HCT-116細胞株的殺傷作用。方法 分離提取健康人外周血單個核細胞誘導成CIK細胞并進行體外擴增培養；采用WST-1法檢測CIK細胞對結腸癌HCT116細胞株的殺傷活性，ELISA法檢測單獨CIK細胞及效靶細胞(CIK細胞混合HCT116細胞)的TNF-α分泌水平。結果 CIK細胞數量在體外培養的第14天達峰值，在培養第9天免疫表型趨于成熟。CIK細胞培養第19天，當效靶比為20∶1時，單獨CIK細胞及效靶細胞培養液TNF-α濃度分別為(18.30±4.87)、(33.57±9.05)ng/mL；效靶細胞培養液TNF-α濃度高于單獨CIK細胞(P<0.05)。效靶比為20∶1時，在培養第14天CIK細胞殺瘤能力最強(P均<0.05)。效靶比為40∶1時，在第9天CIK細胞的殺瘤能力最強(P均<0.05)。結論 CIK細胞在體外對結腸癌HCT-116細胞有較強的殺傷作用，在殺瘤過程中CIK細胞可以促進細胞因子TNF-α的分泌。

結腸腫瘤；HCT-116細胞；CIK細胞；腫瘤壞死因子-α

細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞是由 CD3單抗、IFN-γ及IL-2 等細胞因子在體外刺激外周血單核細胞(PBMC)而產生的一類非特異性新型免疫活性細胞。該細胞既有T 淋巴細胞強大的抗瘤活性，又具備非主要組織相容性復合物限制性殺瘤特點[1]。因此，抗腫瘤過繼免疫治療首選CIK細胞。結腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，中晚期患者治療效果尚不能令人滿意。2016年4～10月本研究通過體外誘導并培養擴增CIK細胞，檢測CIK細胞對結腸癌HCT-116細胞株的殺傷能力以及CIK細胞在殺傷HCT-116時的TNF-α分泌水平，以期為利用CIK細胞治療結腸癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ELISA試劑盒(美國BioLegend公司)、WST-1試劑盒(中國華夏遠洋公司)、FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)、酶標儀(美國Thermo公司)、人結腸癌 HCT116 細胞株(北科生物公司細胞庫)。

1.2 CIK細胞制備 將20 mL DPBS加入CKⅠ、CKⅡ、CKⅢ試劑盒，4 ℃避光過夜包被T175培養瓶制備PBMC細胞。第2天視情況補加CIK細胞培養液60 mL、血漿5 mL、CKⅦ 1 mL。第4天視情況補加CIK細胞培養液50 mL，加入血漿5 mL。第5天加入CKⅧ 1 mL于培養瓶中，將培養瓶中的細胞完全吹打下來以后全部轉移至培養袋，培養基添加細胞至濃度為1×105/mL。

1.3 CIK細胞增觀察及表型檢測 培養過程中動態觀察細胞增殖情況，臺盼藍細胞染色計數細胞擴增倍數。第9天開始收集細胞進行間接免疫熒光抗體染色，經流式細胞儀分析CIK細胞表型，測定CD3+CD56+、 CD3+CD8+雙陽性細胞百分比。

1.4 CIK細胞對結腸癌HCT-116細胞株作用的形態學觀察 把 CIK細胞和結腸癌HCT-116細胞以效靶比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1接種于96孔板，放于37 ℃ 、 5% CO2培養箱培養，設同時鋪板單純培養的結腸癌HCT-116細胞為對照，24 h后置于倒置顯微鏡下觀察共培養細胞與同時鋪板結腸癌HCT-116細胞的形態學差異。

1.5 CIK細胞TNF-α分泌水平檢測 首先通過試劑盒檢測不同濃度TNF-α與吸光度值的關系。然后選取殺瘤能力較強的CIK細胞殺傷結腸癌HCT-116細胞株24 h后，采用ELISA試劑盒檢測不同比例效靶細胞及CIK細胞的TNF-α分泌水平。

1.6 CIK細胞殺傷作用檢測 調整HCT-116細胞濃度為1.0×104/mL，置于96孔平底培養板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后加入不同培養天數不同濃度的CIK細胞100 μL為效應細胞(即效靶細胞組)，并設置效靶比為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1。同時設單獨效應細胞和單獨靶細胞組為對照組，每組設5個復孔，放于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h，然后每孔加WST-1 10 μL，輕微震蕩后繼續培養2.5 h。將96孔板置于酶標儀于450 nm處測定吸光度值(A值)，并計算CIK細胞對HCT-116細胞株的殺傷活性。殺傷活性(%)=1-(效靶細胞A值-單純CIK細胞A值)/單獨靶細胞A值

2 結果

2.1 CIK細胞增殖動態及其表型 PBMC在加入相關刺激因子后，細胞體積逐漸變大，細胞胞質越來越豐富，細胞核逐漸增大。第3～5天細胞開始聚集，成簇狀克隆樣生長。第0～5天CIK細胞增殖不明顯，第9天細胞增值50倍，第5～12天處于快速增殖期，第14天達到增殖高峰，第16～25天細胞數增長不明顯，保持穩定。見圖1。第9天CIK細胞中CD3+CD8+表達為 77.46%，CD3+CD56+表達為7.79%。此時的CIK細胞已經具備一定的殺瘤能力。

2.2 CIK細胞作用后HCT116細胞形態變化 倒置顯微鏡下，結腸癌HCT-116細胞株呈多角貼壁生長，包膜完整，生長旺盛。但CIK細胞與HCT-116作用24 h后，效應細胞聚集在HCT-116周圍，細胞融合脹大并發生吞噬作用，腫瘤細胞HCT-116輪廓模糊不清，外形皺縮，部分細胞裂解。

圖1 不同培養天數CIK細胞數量

2.3 效靶細胞及CIK細胞TNF-α分泌變化 選取培養第19天觀察CIK殺瘤24 h 后不同效靶比的效靶細胞及CIK細胞TNF-α分泌水平，顯示當CIK細胞數為2×105/100 μL，亦即效靶比為20∶1時，效靶細胞TNF-α分泌水平最高(P<0.05)。見表1。

表1 培養19天時不同效靶比效靶細胞及單獨CIK細胞TNF-α分泌水平

2.4 CIK細胞對HCT-116細胞的殺傷效果 在第9、12、14、17、19、24天取效靶比分別為40∶1、20∶1、10∶1及5∶1檢測CIK 細胞進對HCT-1細胞的殺傷效應。當效靶比為20∶1時，在第14天CIK細胞的殺傷效應最強，與第9、12、17、19、24天CIK細胞殺瘤能力兩兩對比有統計學差異(P均<0.05)(見圖2)；在效靶比為40∶1時，在第9天CIK細胞的殺瘤能力最強，分別與12、17、19、24天CIK細胞殺瘤能力兩兩對比有統計學意義(P均<0.05)(見圖3)。

圖2 效靶比20∶1時不同培養時間CIK細胞殺瘤效果

圖3 效靶比40∶1時不同培養時間CIK細胞殺瘤效果

3 討論

結腸癌是全球第三大常見的癌癥，其發病率和病死率僅次于肺癌和胃癌[2]，中晚期患者治療效果不盡如人意。近年來，體外擴增CIK細胞回輸患者體內治療晚期結腸癌已經成為繼手術、放療、化療后的第四種治療模式[3,4]。CIK主要的效應細胞是CD3+CD56+細胞。由于同時表達 CD3 和 CD56 兩種膜蛋白分子，CIK 細胞在表型上兼具 NK 細胞和 T 細胞的表型特征，在功能上也兼具二者的殺傷特點[5,6]。本研究發現，在培養開始的第3～4天, PBMC細胞增殖不明顯, 在第5天，其中的單核細胞開始進入對數生長，第12～14天CIK細胞數達到峰值，在第16天開始細胞數基本保持穩定。提示如收獲CIK細胞用于體外實驗或臨床治療應選擇培養后的第12～16天，這與王家祥等[7]報道稍有不同，此可能與外周血來源及培養方法不同有關。因本研究培養CIK細胞用培養瓶而非培養袋，一定程度上限制了CIK細胞的增殖。CIK細胞在第9天時，CD3+CD8+表達為 77.46%，CD3+CD56+表達為7.79%，此時的CIK細胞已基本成熟，與王士勇等[8，9]報道在成熟時間上有一定差異，這可能與獻血者的個人身體狀況有關。

研究證實，CIK細胞除直接對腫瘤細胞產生殺傷作用外，還能夠通過分泌IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α以及GM-CSF等多種細胞因子繼而調節機體的免疫來進一步增強CIK細胞抗腫瘤活性[10,11]。其中腫瘤壞死因子TNF-α是來源于巨噬細胞和單核細胞的細胞因子，通過活化腫瘤血管導致組織出血壞死和誘導腫瘤細胞凋亡在體內具有抗腫瘤活性。本研究通過檢測不同效靶比情況CIK細胞殺傷HCT-116細胞時TNF-α的分泌水平，證實CIK細胞在殺傷腫瘤細胞HCT-116的過程中能夠促進TNF-α的分泌，

當效靶比為20∶1時，能顯著促進TNF-α的分泌。CIK細胞對多種腫瘤細胞具有殺傷作用，在本研究發現在第9～19天CIK細胞對HCT細胞株的殺傷能力不同效靶比之間存在差異。當效靶比為20∶1時，在第14天CIK細胞的殺傷效應最強；在效靶比為40∶1時，在第9天CIK細胞的殺瘤能力最強。提示采用CIK細胞對結腸癌患者進行臨床細胞免疫治療時不僅要選擇適當培養天數的CIK細胞，而且還需要保證輸注足夠數量的細胞才能確保療效。至于臨床治療所需的最佳細胞培養時間以及針對不同患者所需的細胞數量尚需體內實驗進一步研究。

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崔勇(E-mail:akot@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.013

R735.3

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1002-266X(2017)17-0039-03

2017-02-20)