腦室內注射瘦素對大鼠迷走復合體瘦素受體表達的影響

趙艷軍，馬立新，吳瑞芹，喬躍兵，李炳慶

(1承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；2承德醫學院解剖教研室)

腦室內注射瘦素對大鼠迷走復合體瘦素受體表達的影響

趙艷軍1，馬立新1，吳瑞芹1，喬躍兵2，李炳慶1

(1承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000；2承德醫學院解剖教研室)

目的 探討腦室內注射瘦素后大鼠迷走復合體瘦素受體(Ob-R)表達的變化。方法 將SD大鼠24只隨機分為對照組和瘦素干預1 h組(A組)、3 h組(B組)、5 h組(C組)，每組6只。給藥前1周行側腦室置管，置管1周后無麻醉狀態下對照組側腦室注射生理鹽水， A、B、C組側腦室注射瘦素，劑量均為3.5 μg/μL。實驗結束后取腦組織，用HE染色進行迷走復合體定位，用免疫組化方法測定Ob-R在迷走復合體的表達。結果 A、B、C組Ob-R陽性細胞數分別為(12.49±1.66)、(12.54±2.16)、(12.89±1.86)個，對照組陽性細胞數為(5.66±1.04)個；A、B、C組Ob-R陽性細胞光密度積分分別為 (28.41±3.60)、(26.18±6.17)、(24.56±4.14)分，對照組為(16.02±2.06)分；與對照組比較，A、B、C組Ob-R陽性細胞數、陽性細胞光密度積分增多(P均 <0.05)。A、B、C三組間Ob-R陽性細胞數、陽性細胞光密度積分比較差異無統計學意義(P均 >0.05)。結論 瘦素中樞干預后可刺激迷走復合體上Ob-R的表達上調，瘦素刺激時間與Ob-R水平無關。

瘦素；瘦素受體；阿黑皮素；迷走復合體；側腦室內注射

瘦素屬于蛋白質類激素，由脂肪細胞分泌，主要在白色脂肪組織產生[1]，在神經內分泌、新陳代謝、生殖功能、刺激造血功能以及骨代謝等[2～6]方面均具有生物學活性。研究發現機體內瘦素的減少會引起過量進食，進而導致體質量超標；相反，瘦素通過對靶器官下丘腦的調節，抑制脂肪合成，減少進食，可導致體質量下降[7]。腦干背側的迷走神經復合體包括三部分：迷走運動背核、最后區、孤束核。迷走神經是混合神經，其中運動神經纖維由迷走運動背核發出，感覺纖維的中樞突終止于孤束核，通過迷走反射對靶器官功能(如胃腸動力等)進行調控[8]。研究顯示，瘦素對靶器官調節的生物學作用是通過與瘦素受體(Ob-R)結合而實現的[9]。2015年10月～2016年3月，我們對大鼠中樞神經注射瘦素后迷走神經復合體上Ob-R的表達變化進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠24只(雌雄各半、單籠飼養)、Ob-R(購買于上海斯信生物科技有限公司)、瘦素(派普泰克公司產品)、免疫組織化學方法二抗相關試劑盒、DAB試劑盒、多聚甲醛、大鼠腦立體定向儀、腦室置管系統裝備(包括實驗使用的不銹鋼外套管、與外管相配套的內芯、螺紋釘、螺母、牙科粘合劑、微量注射器)、手術相關器械、光學顯微鏡、Motic計算機圖像分析系統。

1.2 側腦室瘦素注射 將SD大鼠24只隨機分為對照組和瘦素干預1 h組(A組)、3 h組(B組)、5 h組(C組)，每組6只。給藥前1周行側腦室置管，置管1周后對照組側腦室注射生理鹽水， A、B、C組側腦室注射瘦素；注射在大鼠清醒、沒有麻醉狀態下進行，生理鹽水及瘦素注射劑量均為3.5 μg/μL，注射時間為4 min，最后注射美藍溶液0.5 μL(20 g/L)。注射美藍溶液目的是為了確定瘦素注射位置，將美藍未入腦室內的大鼠剔除。

1.3 迷走神經復合體上Ob-R的表達檢測 對照組側腦室注射生理鹽水1 h及A、B、C組側腦室注射瘦素1、3、5 h后，將大鼠以水合氯醛深麻醉，開胸，通過升主動脈先用生理鹽水行心臟灌注，后用甲醛灌注固定。待固定液灌注完畢后取腦組織，再以4%多聚甲醛溶液再固定24 h后取迷走神經復合體，制片后以中腦導水管為標志，HE染色進行迷走神經復合體定位判斷，胞質被染成棕色的為Ob-R表達陽性細胞，采用免疫組化方法測定迷走神經復合體上Ob-R的表達。隨機選取含有陽性細胞的切片組織，然后隨機取6個視野(×400)，計數陽性細胞數。另選6個視野, 每個視野不相互重疊，應用Motic計算機圖像分析系統依據染色的強度和面積，計算各個視野的陽性細胞光密度積分，作為Ob-R表達的定量指標。

2 結果

四組24只大鼠美藍溶液均進入腦室內。A、B、C組Ob-R陽性細胞數分別為(12.49±1.66)、(12.54±2.16)、(12.89±1.86)個，對照組陽性細胞數為(5.66±1.04)個；與對照組比較，A、B、C組Ob-R陽性細胞數增多(P均<0.05)。A、B、C三組間Ob-R陽性細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)。A、B、C組Ob-R陽性細胞光密度積分分別為 (28.41±3.60)、(26.18±6.17)、(24.56±4.14)分，對照組為(16.02±2.06)分；與對照組比較，A、B、C組Ob-R陽性細胞光密度積分增多(P均<0.05)。A、B、C三組間Ob-R陽性細胞光密度積分比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖1 四組迷走神經復合體Ob-R表達比較

3 討論

瘦素是一種由脂肪組織分泌的激素。人們之普遍認為瘦素進入血液循環后會參與糖、脂肪及能量代謝的調節，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體質量減輕。研究表明，在嬰兒時期攝取瘦素，可能可以固定大腦對食欲的反應，進而一生都不會過度飲食。瘦素的功能是多方面的，主要表現在對脂肪及體質量的調控。瘦素可使人類進食明顯減少，體質量和體脂含量下降。瘦素可作用于中樞，增加交感神經活性，使大量貯存的能量轉變成熱能釋放。瘦素可直接抑制脂肪合成，促進其分解。胰島素可促進瘦素的分泌，反過來瘦素對胰島素的合成、分泌發揮負反饋調節。

迷走神經支配整個胃腸系統，腦內向胃腸的傳出纖維由迷走運動背核發出，胃腸向腦內的傳入纖維止于孤束核。迷走神經將胃腸信息整合后向腦內傳遞，經中樞加工后又經傳出纖維指揮胃腸活動，因此迷走神經是腦-腸軸對胃腸運動調節的重要途徑[10]。位于腦干上的迷走運動復合體內，各種神經肽、神經遞質相互作用。不同情況下迷走反射在外周靶器官的作用可能表現為抑制，也可表現為增強[11]。研究表明，許多肽類的激素諸如瘦素、胰島素等均可以作用于腦，通過迷走神經將信息傳遞到胃腸道，從而影響其生物學活性[12]。進一步研究表明，瘦素主要是通過與下丘腦核團上的特異性受體結合，從而發揮其生物學功能。孤束核上的神經元含有Ob-R，而且這類神經元正是Ob-R結合的靶細胞。在孤束核的迷走運動復合體上，是否與下丘腦上的核團(如弓狀核)一樣，瘦素通過與其受體結合實現其對胃腸運動的調控尚不明了。

既往有研究顯示，瘦素作用于動物下丘腦的弓狀核后，該部位Ob-R表達增加，瘦素通過與其受體結合影響胃腸運動，使胃排空延遲，從而產生攝食抑制效應。本研究通過大鼠側腦室置管，在無麻醉狀態下進行中樞注射瘦素，觀察迷走運動復合體上Ob-R的表達變化。結果顯示，瘦素干預后，Ob-R在迷走運動復合體表達增多，與對照組比較有統計學差異。證實在迷走運動復合體上，瘦素可能部分通過與其受體結合實現其對胃腸運動等功能的調控。臨床上肥胖癥患者多出現不同程度的血液瘦素水平上升。由于瘦素的正常生理功能主要是通過Ob-R介導的，肥胖癥患者中瘦素水平的上升直接造成了Ob-R水平的反饋性下調或是受體后信號轉導受阻,這就是瘦素抵抗。腦室內注射瘦素使中樞Ob-R表達增加，從而使瘦素發揮應有的生物學活性，此為相關肽類激素的研究提供了新的思路。但是，人體是一個十分復雜的有機體。孤束核迷走復合體神經元不僅存在Ob-R，同時也存在其他肽類激素受體,中樞注射瘦素后對迷走復合體其他受體影響及其效應也需要進一步的研究。

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河北省科學技術研究與發展計劃項目(08276101D-20)。

李炳慶(E-mail：nobody50@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.012

R745.1

A

1002-266X(2017)17-0037-03

2017-01-23)