miR-451對心肌細胞缺氧再復氧損傷的保護作用及其機制

胡笑容，謝菁，馬瑞松，廖芫熙，李雪飛，江洪

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

miR-451對心肌細胞缺氧再復氧損傷的保護作用及其機制

·論著·

目的 探討miR-451對心肌細胞缺氧再復氧損傷的保護作用及其心肌細胞高遷移率族蛋白1(HMGB1)表達變化。方法 培養乳鼠心室肌細胞，制備缺氧再復氧模型，并隨機分為對照組(Con組)、缺氧再復氧組(AR組)、AR+Ad-GFP組(空病毒組)、AR+Ad-miR-451組(miR-451上調組)、AR+Ad-asmiR-451組(miR-451下調組)。檢測五組心肌細胞存活率、凋亡率以及HMGB1 mRNA、HMGB1和激活細胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)表達水平。利用熒光素酶檢測法在HEK293細胞中進一步確認miR-451對HMGB1作用靶點。結果 與Con組比較，AR組、空病毒組、miR-451上調組、miR-451下調組心肌細胞存活率降低、凋亡率增高，心肌細胞HMGB1 mRNA、HMGB1、激活caspase-3表達增高(P均< 0.05)。與AR組比較，Ad-miR-451組心肌細胞存活率增高、凋亡率降低，心肌細胞HMGB1 mRNA、HMGB1、激活caspase-3表達降低(P均< 0.05)。miR-451識別HMGB1 mRNA的3′端非編碼區并以此為作用靶點抑制HMGB1表達。結論 上調miR-451對心肌細胞缺氧再復氧損傷有保護作用，此作用是通過miR-451抑制HMGB1 mRNA表達而實現的。

心肌細胞；缺氧再復氧損傷；微小RNA-451；高遷移率族蛋白1

心肌缺血再灌注可以引起局部心肌的炎癥反應、活性氧簇的產生及細胞凋亡，這些均可以導致心肌細胞損傷[1]。近期研究顯示，高遷移率族蛋白1 (HMGB1)是一種新的促炎因子，由壞死或凋亡的細胞被動釋放及活化的免疫細胞主動分泌，其在急性肝壞死、房顫、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷等炎癥性疾病中發揮了重要的作用，抑制HMGB1的表達可以減輕心肌缺血再灌注損傷[2,3]。miRNAs是一組小的非編碼RNA，它們通過RNA誘導的沉默復合體發揮對基因表達的負調控作用，導致其靶基因的翻譯抑制或mRNA降解[4,5]。已有研究證實，miRNAs調控了疾病生理過程中所涉及到不同信號通路的關鍵蛋白的表達，如心肌缺血再灌注[6]；在心肌缺血再灌注過程中，miR-1、 miR-21、miR-29、 miR-133、miR-320、miR-451的表達水平均有變化[6～8]。然而，miRNAs和HMGB1的相關性仍不清楚。2016年5～10月，我們就miR-451抑制HMGB1的表達及其對心肌細胞缺氧再復氧損傷的保護作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 腺病毒載體的構建 通過在巨細胞病毒啟動子反向克隆miR-451、反義miR-451原始DNA或空質粒構建miR-451、反義miR-451和空質粒腺病毒(Ad-miR-451、Ad-asmiR-451 和 Ad-GFP)。重組病毒在HEK293細胞中擴增，通過Adeno-XTM純化設備(Microbix, 加拿大)使其滴度達到1011 pfu/mL。

1.2 細胞培養和處理 從武漢大學實驗動物中心購得出生1～3 d的SD大鼠，在同一飼養環境下飼養晝夜交替12 h，讓其自由攝取水和食物。用胰酶消化法制備新生大鼠心室肌細胞[11]，隨機分為5組。對照組(Con組)：心肌細胞在含有15 %胎牛血清的DMEM F12培養液中培養；缺氧再復氧組(AR組)：心肌細胞在上述培養液中培養，缺氧4 h，再復氧2 h；AR+ Ad-GFP組(空病毒組)：缺氧處理前24 h予空病毒(最終感染復數=100，轉染時間=2 h)預處理，后予缺氧再復氧；AR+Ad-miR-451組(miR-451上調組)：缺氧處理前24 h予Ad-miR-451(最終感染復數=100，轉染時間=2 h)預處理，后予缺氧再復氧；AR+Ad-asmiR-451組(miR-451下調組)：缺氧處理前24 h予Ad-asmiR-451(最終感染復數=100，轉染時間=2 h)預處理，后予缺氧再復氧。

1.3 心肌細胞凋亡率檢測 收集預處理后的心肌細胞，用PBS沖洗并使其懸浮于500 μL結合緩沖液，然后用5 μL膜聯蛋白和5 μL碘化丙啶孵育。腺病毒成功轉染細胞的標志為出現綠色熒光蛋白表達。用流式細胞儀測定染色細胞凋亡率。

1.4 心肌細胞存活率檢測 根據說明書用細胞計數工具包CCK-8(Dojindo，日本)檢測細胞存活率。將心肌細胞以1×105個/孔接種于96孔板并孵育4 d。用酶標儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加拿大)檢測每孔在490 nm處吸光度。細胞存活率=(所檢測孔的平均吸光度)/(對照孔的平均吸光度)×100%。

1.5 HMGB1 mRNA表達檢測 用TRIzol試劑盒(Roche，美國)提取總的RNA，并逆轉錄為cDNA。利用SYBR Green-based qPCR工具包(Roche, 美國)實時定量PCR檢測HMGB1 mRNA表達。

1.6 HMGB1、激活細胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)表達檢測 用HMGB1抗體(1∶1 000 稀釋，Sigma，美國)和caspase-3抗體(1∶1 000 稀釋,cell signaling，美國)通過定量免疫印跡分析細胞提取物。以內參GAPDH蛋白條帶光密度值作為標準，采用Western blotting法計算HMGB1、激活caspase-3表達的相對量。

1.7 miR-451的作用靶點檢測 采用熒光素酶法檢測miR-451識別HMGB1 mRNA的3′端非編碼區并抑制HMGB1表達的作用靶點。熒光素酶活性以HEK 293細胞中的Renil laluciferase作為標準，結果以Fluc/Rluc比值表示。

2 結果

2.1 miR-451對心肌細胞存活率、凋亡率的影響 見表1。

表1 五組心肌細胞存活率、凋亡率比較

注：與Con組比較，#P<0.05；與AR組比較，*P<0.05。

2.2 心肌細胞中HMGB1、激活caspase-3表達 染色結果顯示，未行缺氧再復氧處理時，大多數HMGB1定位于細胞核內。在缺氧再復氧中，大部分HMGB1從細胞核遷移至細胞質內。miR-451的上調能減少HMGB1由胞核向胞質的遷移，而miR-451的下調并不影響遷移。五組心肌細胞HMGB1 mRNA、HMGB1、激活caspase-3表達差異。見表2。

2.3 miR-451的作用靶點 熒光素酶檢測證實心肌細胞內HMGB1 mRNA是miR-451作用的一個靶基因。HMGB1 mRNA的3′端非編碼區包含了miR-451結合序列或突變的miR-451結合序列，這個結構被克隆至熒光素酶報告基因中，并被轉染至帶有空質?；虮磉_miR-451質粒的HEK 293細胞中。miR-451可直接綁定至HMGB1 mRNA并抑制其表達。

表2 五組心肌細胞HMGB1 mRNA、HMGB1和激活caspase-3表達比較

注：與Con組比較，#P<0.05；與AR組比較，*P<0.05。

3 討論

以往研究顯示，在乳腺癌、白血病、氧化應激等病理過程中miR-451對細胞的死亡及存活中發揮了重要作用[9,10]。本研究發現在心肌細胞缺氧再復氧中miR-451能抑制細胞凋亡并提高細胞的存活率。Ren等[6]發現在大鼠心肌缺血再灌注模型中，miR-451表達水平顯著降低。近期研究顯示，miR-144 和 miR-451過量表達均可增加心肌細胞存活，兩者均可通過密碼子綁定環氧合酶2途徑發揮心肌缺血再灌注中心肌細胞保護作用。缺血預處理是減輕缺血再灌注損傷的一個經典有效的方法，Wang等[11]進一步發現缺血預處理并不能減輕miR-144/451基因敲除小鼠的缺血再灌注損傷。以上研究表明，過表達的miR-451在心肌缺血再灌注損傷模型中發揮保護作用。

HMGB1在肝、腦、肺、心臟缺血再灌注損傷中具有重要的作用[12]。一旦從壞死細胞或活化的免疫細胞釋放出來，HMGB1可觸發下游的炎癥過程，并與其他促炎因子(如TNF-α、IL-6和C反應蛋白)相互作用，這些炎癥因子最終導致細胞凋亡[13,14]。此外，已有研究證實，HMGB1是心肌缺血再灌注損傷早期的炎癥介質，亦可以促進TNF-α、IL-6的釋放[2]。HMGB1拮抗劑可以減少心肌缺血再灌注損傷并抑制TNF-α、IL-6的釋放，提高心肌細胞的存活率。miRNA是基因表達的內源性調控因素。本研究顯示，上調miR-451表達水平，心肌細胞HMGB1 mRNA、HMGB1、激活caspase-3表達降低，心肌細胞存活率增高、凋亡率降低。HMGB1 mRNA和蛋白水平改變水平的一致性提示，HMGB1可能是miR-451潛在的基因作用靶點，miR-451可能是通過抑制mRNA和阻礙翻譯過程而抑制HMGB1的表達。本研究應用HMGB1 mRNA 3′端非編碼區碎片與miR-451假定結合部位進一步證實了miR-451和HMGB1的關聯性。miR-451通過抑制HMGB1的表達減輕心肌細胞缺氧再復氧損傷。

需要指出的是本研究具有以下局限性。首先，調控HMGB1是miR-451在心肌細胞缺氧再復氧損傷發揮保護作用的可能機制之一，預測軟件已預測出大量miR-451調控的潛在靶點，因此需要進行更多的靶點確認實驗。其次，本研究并未涉及到心肌細胞缺氧再復氧中miR-451調控HMGB1表達的分子機制，仍需更多的研究加以闡明。

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Protective effect of miR-451 on anoxia/reoxygenation injury in cardiomyocytes

HUXiaorong,XIEJing,MARuisong,LIAOYuanxi,LIXuefei,JIANGHong

(RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To investigate the protective effect of microRNA-451 (miR-451) on anoxia/reoxygenation (A/R) injury in cardiomyotes and high mobility group box 1 protein (HMGB1) expression. Methods Neonatal rat ventricular cardiomyocytes were prepared and then subjected to A/R injury. Then they were divided into the control group (Con group), anoxia and reoxygenation group (AR group), AR+Ad-GFP group (empty virus group), AR+Ad-miR-451 group (miR-451 up-regulation group), AR+Ad-asmiR -451 group (miR-451 down-regulation group). We detected the cell viability, apoptosis rate, and the expression of Caspase-3 and HMGB1, HMGB1 mRNA. The luciferase assay was performed to further confirm MiR-451 targets for HMGB1.Results Compared with the Con group, the cell viability decreased, apoptosis index (AI) and the expression of Caspase-3, HMGB1 and HMGB1 mRNA increased in the other four groups (allP<0.05). Compared with AR group, cell viability increased, apoptosis index (AI) and the expression of Caspase-3, HMGB1 and HMGB1 mRNA decreased in the Ad-miR-451 group (allP<0.05). The luciferase assay confirmed that the 3'UTR of HMGB1 mRNA was a direct target of miR-451 in cardiomyocytes, which inhibited the expression of HMGB1. Conclusion The up-regulation of miR-451 could protect A/R injury-induced cardiomyocytes by inhibiting HMGB1 expression through miR-451.

cardiomyocytes; anoxia/reoxygenation injury; microRNA-451; high mobility group box 1 protein

國家自然科學基金資助項目(81370308)。

胡笑容(1981-)，男，副主任醫師，博士，主要研究方向為缺血性心肌病和介入心臟病學。E-mail：huxrwurm@163.com

江洪(1956-)，男，主任醫師，博士生導師，博士，主要研究方向為介入心臟病學和心電生理。E-mail:Jianghwurm@163.com

胡笑容，謝菁，馬瑞松，廖芫熙，李雪飛，江洪

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.001

R541.4

A

1002-266X(2017)17-0001-03

2016-09-14)