不同程度扁平苔蘚患者治療前后唾液中IL-17與念珠菌水平變化①

朱建華，苗藝?yán)_，劉繼光

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

不同程度扁平苔蘚患者治療前后唾液中IL-17與念珠菌水平變化①

朱建華，苗藝?yán)_，劉繼光

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討扁平苔蘚患者口腔念珠菌定殖數(shù)量與唾液中白細(xì)胞介素17(IL-17)表達(dá)水平及其之間的關(guān)系。方法：選取40例口腔扁平苔蘚伴有唾液念珠菌鏡檢陽性的患者，局部應(yīng)用制霉菌素抗真菌治療，并采集患者治療前后的唾液，應(yīng)用含漱液濃縮培養(yǎng)法檢測(cè)念珠菌定殖數(shù)量，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)唾液IL-17表達(dá)水平，通過單位體積唾液念珠菌數(shù)量分為念珠菌感染組(實(shí)驗(yàn)組)和非感染組(對(duì)照組)，并分別記錄兩組治療前后念珠菌記數(shù)的變化和IL-17水平的變化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過治療，il-17表達(dá)水平(11.47±3.71)ng/L明顯低于治療前(8.30±2.85)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),口腔念珠菌數(shù)量與唾液IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.427，P=0.006);對(duì)照組在治療前后il-17表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論：念珠菌感染可以引起扁平苔蘚患者唾液中il-17含量的升高，通過抗念珠菌治療可以減少扁平苔蘚患者唾液IL-17表達(dá)水平。

口腔扁平苔蘚；白色念珠菌；白細(xì)胞介素17；唾液

扁平苔蘚是常見的皮膚黏膜病變。最先被Wilson在1869年發(fā)現(xiàn)并且影響0.5%～1%世界人口[1]。病變可以影響?zhàn)つず推つw，有時(shí)兩者共存，OLP可能的病因包括(1)遺傳因素(2)牙科材料(3)用藥(4)感染因素-微生物或病毒(5)自身免疫(6)免疫缺陷(7)食物過敏(8)精神壓力(9)不良習(xí)慣(10)創(chuàng)傷(11)糖尿病和高血壓[2]。大量研究?jī)A向于免疫因素，特別是朗格漢斯細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的激活[3]。呈遞抗原給CD4+T細(xì)胞，這些細(xì)胞分泌IFN-β，它是一個(gè)Th1細(xì)胞因子，可以激活CD8+毒性T細(xì)胞導(dǎo)致基底細(xì)胞凋亡，但是除了傳統(tǒng)的Th1,Th2細(xì)胞，Th17細(xì)胞組成了第三個(gè)具有特定功能的效應(yīng)T細(xì)胞的子集，Th17細(xì)胞在宿主對(duì)抗特定病原體比如白色念珠菌和特定細(xì)胞外細(xì)菌都有影響，然而廣泛的IL-17的受體分布導(dǎo)致Th17細(xì)胞激活可以引起嚴(yán)重的組織反應(yīng)，有可能是潛在的自身免疫炎癥的病因。口腔是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)包括多種黏膜上皮細(xì)胞，并不斷的接受唾液的沖洗。口腔念珠菌是人類最易感染的微生物，特別是生命中的早期與晚期階段，在普通人群中，無癥狀念珠菌攜帶率在20%～75%，其中新生兒攜帶率為45%，健康兒童為45%～65%，健康成人為30%～45%，帶有可摘義齒人群為50%～65%，接受化療的急性白血病患者為90%，HIV陽性患者為95%。白色念珠菌是口腔正常菌群，在健康人中一般不引起任何癥狀，但是若菌群的過度生長(zhǎng)會(huì)引起局部組織不適，味覺的改變以及吞咽困難，甚至免疫功能異常的患者感染可以擴(kuò)散到血液或胃腸道。系統(tǒng)念珠菌病死亡率達(dá)71%～79%[4,5]。OLP病理表現(xiàn)是局部上皮細(xì)胞破壞，念珠菌對(duì)上皮的附著是感染的第一步，因其不受唾液沖刷的影響，念珠菌感染也可能是繼發(fā)于OLP病變之后，并且加重OLP的體征(局部不適和燒灼感)。大量研究表明口腔扁平苔蘚患者念珠菌感染幾率高于健康人[6]。有實(shí)驗(yàn)說明Th17細(xì)胞途徑在黏膜和上皮特別是口腔黏膜和口外皮膚對(duì)真菌的免疫中扮演了重要的角色[7]。但是念珠菌感染和扁平苔蘚的因果關(guān)系暫時(shí)不明確。本研究的目的是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢扁平苔蘚伴白念感染的患者在抗真菌治療前后，唾液中念珠菌水平與唾液中的炎癥因子IL-17水平表達(dá)差異和相互作用關(guān)系，探討抗真菌治療對(duì)于扁平苔蘚臨床治療的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

40例OLP患者選自佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周病門診。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)在佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院就診的病理診斷為扁平苔蘚患者。(2)行微生物學(xué)檢查結(jié)果為白色念珠菌陽性并且菌落數(shù)CFU/mL>400。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)有過放射治療史。(2)牙體、牙周組織及口腔黏膜病變。(3)長(zhǎng)期或近期(4周內(nèi))使用廣譜抗生素。(4)妊娠；吸煙。采集未刺激全唾液、含漱液，共采集樣本40例，男14例，女26 例，年齡60～89歲，平均69歲，其中唾液培養(yǎng)菌落陽性患者(CFU>400/mL)20例，真菌培養(yǎng)陰性患者(0

1.2 方法1.2.1 唾液樣本收集

采集樣本前30min所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象禁食,清水含漱后于早上 9：00-10：00期間,靜坐,頭前傾略低,向無菌離心管內(nèi)緩緩流入非刺激性唾液5mL.采集的唾液于1h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，1.5mL分裝，-80℃冰箱保存。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù)

顯色瓊脂培養(yǎng)基中上面生長(zhǎng)翠綠色的菌落。

1.2.3 用ELISA試劑盒測(cè)定唾液IL-17濃度

患者靜坐5min后用10mL0.01mmol滅菌PBS緩沖液含漱，將含漱液放入無菌離心管內(nèi)。標(biāo)本于1h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，將采集的漱口液于4000r/min4℃離心10min，除去上清液，重新混勻,分別取100μL混懸液接種于3個(gè)顯色瓊脂培養(yǎng)基。37℃孵育48h后觀察菌落并記錄下3個(gè)培養(yǎng)基中菌落形態(tài)及總菌落數(shù)(CFU)。結(jié)果判定參照試劑手冊(cè)。以健康對(duì)照者為陰性對(duì)照；經(jīng)滅菌處理的空培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組20例患者中男4例，女16例,平均年齡(69.9±7.71)歲。對(duì)照組男3例，女17例，平均年齡(66.9±4.41)歲，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組患者唾液念珠菌數(shù)量比較：實(shí)驗(yàn)組20例有16例口腔念珠菌數(shù)量大于400CFU/mL，對(duì)照組20例均小于400CFU/mL,經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組念珠菌數(shù)量比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P<0.05)見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組口腔念珠菌數(shù)量比較(CFU/mL)

注：P<0.05

2.3 兩組患者唾液中IL-17水平變化的比較：ELISA測(cè)定樣本中IL-17濃度，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組治療前后的變化以及對(duì)照組治療前后的變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)，結(jié)果服從正態(tài)分布，用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示結(jié)果；對(duì)照組患者治療前后IL-17水平無明顯差異(P=0.227)。見表2。

分組治療前il-17濃度治療后il-17濃度實(shí)驗(yàn)組11.47±3.718.30±2.85對(duì)照組4.40±1.765.11±1.91

注：P=0.227

2.4 口腔念珠菌數(shù)量和唾液IL-17水平的相關(guān)性分析：對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別作pearson相關(guān)性分析。結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組口腔念珠菌與唾液il-17水平成正相關(guān)(r=0.427,P=0.006),對(duì)照組二者無相關(guān)性(P=0.170)。見表3～4。

表3 實(shí)驗(yàn)組口腔念珠菌數(shù)量和唾液IL-17濃度相關(guān)性

注：P=0.006

表4 對(duì)照組口腔念珠菌數(shù)量和唾液IL-17濃度相關(guān)性

注：P=0.170

3 討論

念珠菌感染被分為原發(fā)性和繼發(fā)性，繼發(fā)性感染時(shí)疊加在其他疾病病變部位基礎(chǔ)之上，比如OLP，可以增加念珠菌病的易感性。有關(guān)口腔念珠菌病與口腔扁平苔蘚之間的關(guān)系已有學(xué)者研究有的學(xué)者觀察到糜爛型OLP與非糜爛型OLP的念珠菌數(shù)量無顯著差別，指出念珠菌并非糜爛型OLP的病因。亦有學(xué)者指出糜爛型OLP較非糜爛型OLP有更高的念珠菌檢出率[6]。因而念珠菌感染是OLP的病因還是因?yàn)镺LP導(dǎo)致的念珠菌感染還需要進(jìn)一步研究。

白細(xì)胞介素17是促炎細(xì)胞因子，可以導(dǎo)致多種炎性疾病，大量大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定IL-17和TH17細(xì)胞在炎性疾病，自身免疫疾病以及宿主抵抗中起到相關(guān)病原體的作用。相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果表明:通過抑制IL-17細(xì)胞因子的釋放對(duì)治療銀屑病，關(guān)節(jié)炎等自身免疫病有臨床效果[8]。IL-17的過度表達(dá)可以在多種自身免疫病和炎性疾病中觀察到，該細(xì)胞因子起到的病理作用早已經(jīng)被證實(shí)[9]。而扁平苔蘚是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫疾病，所以IL-17細(xì)胞因子在局部炎癥反應(yīng)中起了至關(guān)重要的作用，人類念珠菌反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞表達(dá)Th17標(biāo)記物比如IL-17。亦有研究表明炎癥反應(yīng)會(huì)增加白色念珠菌局部感染幾率，同時(shí)念珠菌定殖會(huì)阻礙病變的恢復(fù)，從而形成惡性循環(huán)：局部炎癥反應(yīng)的存在改變了局部菌群的結(jié)構(gòu)，形成了有利于大量念珠菌定殖的環(huán)境，加重疾病反應(yīng)。以往研究表明:IL-17以及其他Th-17細(xì)胞因子在宿主黏膜表面通過引導(dǎo)固有免疫比如(中性粒細(xì)胞激活因子，抗菌肽)來防御病原體。大鼠實(shí)驗(yàn)觀察胃部及口腔白色念珠菌的定殖導(dǎo)致IL-17和IL-23釋放的增加[10]，因此念珠菌感染提高了機(jī)體細(xì)胞因子的釋放IL-17進(jìn)一步使炎癥反應(yīng)加重。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示口腔扁平苔蘚伴有念珠菌感染患者口中唾液白色念珠菌水平與白細(xì)胞介素17濃度呈正相關(guān)，說明通過減少扁平苔蘚病變部位白色念珠菌數(shù)量可以降低唾液中炎癥因子的濃度，說明白色念珠菌作為扁平苔蘚可能的致病因素之一，可以引起患者局部病變部位IL-17細(xì)胞因子濃度增加，加重局部炎癥反應(yīng)，從而為通過治療白色念珠菌病來治療扁平苔蘚提供臨床依據(jù)。

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佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目,編號(hào)：YM2016-073。

朱建華 (1959～)女，黑龍江佳木斯人，本科，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

劉繼光(1961～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:miao.miao@me.com。

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1008-0104(2017)02-0040-02

2016-10-09)