大鼠腹主動脈瘤中早期生長反應因子1mRNA表達水平的研究①

董海鵬，王 石，劉程偉，徐桂超，金 松

(佳木斯大學附屬第一醫院血管外科，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠腹主動脈瘤中早期生長反應因子1mRNA表達水平的研究①

董海鵬，王 石，劉程偉，徐桂超，金 松

(佳木斯大學附屬第一醫院血管外科，黑龍江 佳木斯 154003)

早期生長反應因子-1；腹主動脈瘤；q-PCR

早期生長反應因子-1 (Earlygrowthresponse1，Egr-1)是重要的核轉錄因子。在調控細胞的生長、分化、發育、增殖、炎性反應等方面發揮重要作用，并且參與多種動脈疾病的發生和發展[1,2]。本研究旨在建立大鼠腹主動脈瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)灌注模型的基礎上，應用q-PCR技術檢測Egr-1在正常動脈及動脈瘤組織中的表達，以探討其在腹主動脈瘤發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型

雄性SD大鼠20只(遼寧長生生物技術有限公司提供)，體重250～300g，動物隨機分為2組：對照組(正常大鼠腹主動脈)，實驗組(彈力蛋白酶灌注)，每組10只。所有的動物都根據中國現行法律對實驗動物的護理及保護原則進行試驗。大鼠經3%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg，腹腔注射)，然后固定在手術臺上。切開皮膚及腹壁各層，顯露游離腎下腹主動脈和下腔靜脈，于左腎靜脈下方游離長約1cm的腹主動脈主干，與左腎動脈開口下方阻斷血流，經左側髂總動脈插入導管直至腹主動脈上部，結扎腹主動脈分叉上方使其成為一個內含導管的密閉管腔，灌注1mL(20u)彈力蛋白酶持續灌注 30min。14d后收集標本，將標本剪碎放入1mLTrizoL并放入-80℃中保存。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應

取灌注后的腹主動脈用Trizol試劑提取總RNA(Invitrogen)，測定RNA的純度及濃度用NanoDrop1000 (NanoDrop,Wilmington,DE)。用PrimeScriptTMRT試劑盒，將樣品總RNA逆轉錄成cDNA。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應采用SYBRGreenPCRMasterMix(takara)在ABI7500Real-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)中進行實時定量。循環參數如下：95℃變形30s，95℃ 5s，60℃ 30s順序循環40次。在PCR中使用的引物 ，Egr-1引物：上游引物5’-CAGGAGTGATGAACGCAAGA-3’,下游引物5’-GGGGATGGGTAGGAAGAGAG-3’；β-actin引物：上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。測定目標基因的表達，以β-actin為內參，用2-△△CT法測定目標基因的表達。每個樣本做三次獨立重復試驗。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠腹主動脈瘤模型的建立

腹主動脈瘤是指腹主動脈呈瘤樣擴張，通常直徑增大50%以上定義為動脈瘤。根據測量腹主動脈直徑得出實驗組動物模型均已達到腹主動脈瘤診斷標準(對照組：1.400±0.033, 實照組：2.950±0.171,每組10只，P<0.05)。見圖1。

2.2Egr-1mRNA的表達在腹主瘤中表達升高

可以看出在腹主動脈瘤組中Egr-1mRNA的表達水平明顯升高，而正常腹主動脈中Egr-1mRNA的表達很低(對照組：1.026±0.122, 實驗組：6.177±0.721，P<0.05)。見圖2。

圖1 大鼠灌注前后腹主動脈瘤的直徑注：對照組為正常腹主動脈直徑，實驗組為灌注后14d直徑P<0.05。

圖2 q-PCR檢測 Egr-1 mRNA的表達

注：對照組和實驗組(彈力蛋白酶灌注組)(P<0.05)。

3 討論

腹主動脈瘤(AbdominalAorticAneurysm,AAA)的發生發展過程一直是血管外科研究的重點內容之一。許多學者根據近年來對腹主動脈瘤發病機理的認識,想通過建立實驗動物模型,誘導產生與人類腹主動脈瘤形成機理相似的動物模型,對其發病原因、發病機理等表現進行進一步研究,并進一步探索藥物預防及治療的方法。1990年Aindjar[3]等研究發現人腹主動脈瘤組織中彈力蛋白明顯減少,從而創立了大鼠腎下腹主動脈加壓灌注彈力蛋白酶的方法,建立腹主動脈瘤動物模型。因其具有與人類腹主動脈瘤形成有相似的發病機制和病理特點,現已被廣泛接受。彈力蛋白酶灌注腹主動脈瘤的特點是主動脈壁的炎癥反應炎并產生大量促炎細胞和因子如巨噬細胞，腫瘤壞死因子(TNF-α)[4]，白細胞介素1(IL-1b),轉換生長因子(TGF-b)，基質金屬蛋白酶[5]等。中層平滑肌細胞減少[6]，細胞外基質的破壞和降解導致動脈管腔逐漸擴張。

早期生長反應因子1，是一種鋅指狀的早期轉錄因子。Egr-1 參與多種病理生理過程如細胞增殖、分化及凋亡[7]，炎癥反應[8]、血栓形成、細胞外基質的合成與降解等。我們的研究結果表明Egr-1mRNA在腹主動脈瘤中表達升高，可能是Egr-1參與調節炎癥反應，細胞外基質降解，平滑肌細胞的遷移等。Harja[9]研究表明不同周齡的apoE-/-小鼠血管壁中Egr-1表達情況，而Egr-1的下游炎癥因子的表達也同步上調。此外，apoE、Egr-1雙敲除小鼠血管壁中炎性因子明顯減少，提示Egr-1 可能通過調控其下游炎癥基因的表達而影響AAA的發生和發展。多種因素可以刺激內皮細胞Egr-1 表達上調，不僅促進內皮細胞自身的增殖分化及遷移，還促使細胞分泌基質金屬蛋白酶，而細胞增殖分化和遷移也會破壞血管壁正常結構促進腹主動脈瘤的形成。Egr-1還能夠激活MMP-2，與MT1-MMP的表達相關，Egr-1可以結合到MT1-MMP的結合位點[10]，這些因子的表達都受Egr-1的調控，而MMP在細胞外基質的破壞，降解和炎癥反應中起重要作用[11]，尤其是基質金屬蛋白酶2(MMP-2)[12]和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)[5]。這些因素都可能促進腹主動脈瘤的形成。

本實驗證實，Egr-1mRNA在大鼠腹主動脈瘤中大量表達使Egr-1成為參與腹主動脈瘤的發生發展過程，說明其與腹主動脈瘤的發病機制密切相關，使Egr-1成為防治AAA的新靶點，但其通過何種機制發揮作用，尚需進一步探討。

[1]LongoGM,XiongW,GreinerTC,etal.Matrixmetalloproteinases2and9workinconcerttoproduceaorticaneurysms[J].JClinInvest, 2002, 110(5): 625-632

[2]CheyouER,YourevaV,SrivastavaAK.Involvementoftheearlygrowthresponseprotein1invascularpathophysiology:anoverview[J].IndianJBiochemBiophys, 2014, 51(6): 457-466

[3]AnidjarS,SalzmannJL,GentricD,etal.Elastase-inducedexperimentalaneurysmsinrats[J].Circulation, 1990, 82(3): 973-981

[4]楊福義,高涵,趙梓涵.TNF-α和sICAM-1在顱內動脈瘤的表達[J].黑龍江醫藥科學,2016,39(3):53-54

[5]劉傳玉,劉程偉,袁魁,等.MMP_9_TIMP_1在曲張大隱靜脈中的表達及意義[J].黑龍江醫藥科學,2014,37(4)：18-19

[6]LiuY,WangTT,ZhangR,etal.Calorierestrictionprotectsagainstexperimentalabdominalaorticaneurysmsinmice[J].JExpMed, 2016, 213(11): 2473-2488

[7]PagelJI,DeindlE.Earlygrowthresponse1--atranscriptionfactorinthecrossfireofsignaltransductioncascades[J].IndianJBiochemBiophys, 2011, 48(4): 226-235

[8]WangNP,PangXF,ZhangLH,etal.Attenuationofinflammatoryresponseandreductionininfarctsizebypostconditioningareassociatedwithdownregulationofearlygrowthresponse1duringreperfusioninratheart[J].Shock, 2014, 41(4): 346-354

[9]HarjaE,BucciarelliLG,LuY,etal.Earlygrowthresponse-1promotesatherogenesis:micedeficientinearlygrowthresponse-1andapolipoproteinEdisplaydecreasedatherosclerosisandvascularinflammation[J].CircRes, 2004, 94(3): 333-339

[10]HaasTL,StitelmanD,DavisSJ,etal.Egr-1mediatesextracellularmatrix-driventranscriptionofmembranetype1matrixmetalloproteinaseinendothelium[J].JBiolChem, 1999, 274(32): 22679-22685

[11]PafiliK,Gouni-BertholdI,PapanasN,etal.Abdominalaorticaneurysmsanddiabetesmellitus[J].JDiabetesComplications, 2015, 29(8): 1330-1336

[12]王海嬌,李麗疆,宋漢君,等.基質金屬蛋白酶-2與2型糖尿病大血管病變的研究進展[J].黑龍江醫藥科學,2013,36(1):83-84

Expression of early growth response factor-1 mRNA in rat abdominal aortic aneurysm (AAA) pathogenesis

DONGHai-peng,WANGShi,LIUCheng-wei,XUGui-chao,JINSong

(Department of Vascular Surgery，The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Egr-1; abdominal aortic aneurysm; Quantitative real-time polymerase chain reaction (q-PCR)

1.國家自然科學基金 ，編號：30801123, 81070254；2.教育部留學回國人員科研啟動基金，編號：教外司留【2014】1685 號。

董海鵬(1990～)男，黑龍江尚志人，在讀碩士研究生，醫師。

劉程偉(1976～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫師，副教授，碩士研究生導師。E-mail：liucwcw@163.com。

R

A

1008-0104(2017)02-0001-02

2016-07-20)