石橄欖種子無菌播種和快速繁殖研究

林輝鋒 陳昌銘 尚偉 林發壯 夏朝水 周輝明

摘要[目的]建立石橄欖種子無菌播種和快速繁殖技術體系。[方法]以MS為基礎培養基，添加不同濃度6-BA、NAA、有機添加物，篩選適宜的誘導、增殖及壯苗生根培養基組合。[結果]以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L為石橄欖種子最佳誘導培養基，14 d可見種子萌動，45 d可分化形成叢生幼苗；以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L為最佳增殖培養基，其增殖倍數可達2.750倍，假鱗莖形成率達24.5%；以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L為最佳壯苗生根培養基，苗高可達3.82 cm，根數1.9條。[結論]該研究為石橄欖野生種質資源保護、快速繁育優質種苗奠定了基礎。

關鍵詞石橄欖；無菌播種；組織培養

中圖分類號S567文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0161-02

Study on Aseptic Sowing and Rapid Propagation Technology for Pholidota chinensis Lindl. Seed

LIN Huifeng， CHEN Changming， SHANG Wei， ZHOU Huiming* et al（Sanming City Agricultural Science Research Academy，Sanming，Fujian 365051）

Abstract[Objective] To establish a system of aseptic sowing and rapid progagation technology for Pholidota chinensis Lindl..[Method]Different concentrations 6BA， NAA， organic additives were added to MS medium to screen the suitable induction， proliferation and strong seedling and rooting medium. [Result]The proper medium for the seeds induction of P. chinensis Lindl. was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L + coconut juice 50 mL/L， seed germination was observed on 14 days，the differentiation and formation of clusters of seedlings were observed on 45 days；the best multiplication medium was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+coconut juice 50 mL/L，proliferation times 2.750，the pseudobulb formation rate up to 24.5%； the best seedling rooting medium was 1/2MS medium containing NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L，plant length up to 3.82 cm，root number 1.9.[Conclusion]The study laid a foundation for the conservation of wild germplasm resources and rapid breeding of high quality seedling.

Key wordsPholidota chinensis Lindl.；Aseptic sowing；Tissue culture

石橄欖學名石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.），系蘭科石仙桃屬多年生附生草本植物，在李時珍的《本草綱目》中有詳細記載，其具清熱養陰、化痰止咳、潤肺生津、利濕、消瘀等藥用功效，可應用于頭痛、眩暈、肺熱咳嗽、火郁胃痛、熱痹、夢遺、熱淋、胃火牙痛、虛火喉痛等癥狀治療，由于其藥效廣泛，人們習稱為“仙桃”[1]。其提取物制成的單方制劑——頭痛定糖漿，為國家準字號藥品，臨床上用于治療神經機能性頭痛、腦震蕩后遺癥，療效明顯，年產值達1 500萬元。在民間，石仙桃作為一種藥食兩用的食材有清疏肺熱、肝火，養陰生津的功效，是煲湯的常用材料。藥用石橄欖多數為野生資源，而野生石橄欖資源再生緩慢，其種子在自然狀況下極難萌發，如依靠分株繁殖，則繁育周期較長，繁殖率極低，遠不能滿足規模化生產需求，且當前市場上的石橄欖品質參差不齊。利用組織培養方法繁殖石橄欖，可有效地穩定其品性，增加繁殖系數，縮短培育周期，從而彌補石橄欖野生種質資源嚴重不能滿足市場需求的不足，達到對石橄欖野生種質資源保護的目的。

在石橄欖相關的組培快繁上，未見有系統的研究報道，僅王蓮輝等[2]以尖葉石仙桃蒴果內的種子為材料研究了尖葉石仙桃的胚培養與快速繁殖，但其選用的尖葉石仙桃產地未描述。福建藥用石橄欖以細葉石仙桃和石仙桃為主[3-4]，其組培快繁研究未見報道。筆者以石橄欖種子作為外植體，通過不同有機添加物種類、不同生長調節劑配比、不同基礎培養基成分研究，篩選適宜的誘導、增殖及壯苗生根培養基配方，從而縮短快繁周期，以期為石橄欖的產業化栽培提供優質種苗。

1材料與方法

1.1材料

外植體材料為采自于三明市農業科學研究院植物園的成熟未開裂石橄欖蒴果。

1.2方法

1.2.1種子消毒。

用棉花蘸取洗潔精將蒴果表面清洗干凈，在自來水下沖洗20 min左右，無菌條件下，72%乙醇處理45 s，無菌水清洗3遍，用0.1%HgCl2浸泡消毒10 min，無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干。用手術刀將消毒好的蒴果切開，將種子撒到裝有無菌水的錐形瓶中，搖勻，每瓶接種1 mL。

1.2.2培養條件。

使用200 mL廣口瓶為培養容器（下同），每瓶加入30 mL培養基，培養基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉5 g/L，pH 5.6，培養溫度（25±1）℃，光照強度2 000 lx。

1.2.3無菌播種初代誘導培養。

以MS為基本培養基，將用無菌水懸浮稀釋消毒后的種子，接種于添加不同激素的MS萌發誘導培養基上，培養基配方為①MS；②MS+椰子汁50 mL/L；③ MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；④MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L；⑤MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L；⑥MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭（AC）1 g/L，觀察不同培養基對種子萌發的影響。

1.2.4增殖培養。

以MS添加50 mL/L椰子汁為基礎培養基，設置6-BA（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L）2因素5水平試驗，增殖培養60 d后統計植株假鱗莖形成率和種苗增殖倍數。植株假鱗莖形成率=統計時植株帶假鱗莖數/統計時植株數×100%；種苗增殖倍數=統計時植株數/接種時種苗數。

1.2.5壯苗生根培養及煉苗移栽。

以1/2MS添加1 g/L AC為基本培養基，添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L），壯苗生根培養30 d，統計苗高、根數。將生根好的植株先放在溫室大棚煉苗4 d，揭開瓶蓋繼續煉苗3 d，洗凈培養基，用稀釋800倍的甲基硫菌靈浸泡10 min后，移栽于珍珠巖∶沙土=1∶1的基質中，保持空氣濕度75%以上，環境溫度18～28 ℃。

1.3統計分析方法采用DPS數據處理軟件進行統計和分析。

2結果與分析

2.1無菌播種初代誘導培養

石橄欖種子較小，45 d后可形成幼苗。無菌初代培養需散光，培養14 d時，可見種子有綠色萌動，在培養0～21 d時，處理⑥中的種子萌動較好，培養22～45 d時幼苗長勢較弱；處理④在培養0～21 d時萌動較為緩慢，培養22～45 d時長勢快且好；處理⑤種子萌動無論前期還是后期均表現弱勢；處理①和②種子萌動

無論是前期還是后期長勢均相當，處理③較之種子萌動長勢弱。試驗結果表明，以處理④（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L）為石橄欖種子誘導培養基最佳。

2.2石橄欖的增殖培養

將初代誘導培養出的石橄欖種苗接種于各增殖培養基上，結果顯示6-BA和NAA對石橄欖增殖影響較大，從石橄欖種苗假鱗莖形成率來看，6號培養基中表現最高（40.6%），但其增殖倍數不高，說明低濃度的NAA能夠促進石橄欖假鱗莖的形成。從6-BA和NAA對石橄欖種苗增殖倍數影響來看，在6-BA為1.0 mg/L、NAA為0.1 mg/L時，表現最好，達2.750倍，其假鱗莖形成率雖然只有24.5%，但其形成數與6號培養基上的表現相當。由表1可知，高濃度的6-BA（2.0、4.0 mg/L）和高濃度的NAA（0.4、0.8 mg/L）組合抑制了假磷莖的形成且增殖倍數較低，種苗矮小。研究認為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L為最佳增殖培養基。

2.3石橄欖壯苗生根培養及馴化移栽

由表2可知，相比沒有添加NAA的對照，添加NAA對石橄欖生根無顯著差異，而對石橄欖壯苗影響上，以低濃度0.1 mg/L為極顯著差異。其中以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L為最佳壯苗生根培養基，表現為當帶假鱗莖石橄欖植株接種于壯苗生根培養基后，14 d即有新根長出，30 d后生根數可達1.9條，苗高 3.82 cm。煉苗移栽是將生根植株煉苗7 d，用稀釋800倍的甲基硫菌靈浸泡10 min后，移栽于珍珠巖∶沙土=1∶1的基質中，保持空氣濕度75%以上，環境溫度18～28 ℃，成活率

3討論

石橄欖系蘭科石仙桃屬多年生附生草本植物，其種子較小，在自然狀況下極難萌發，因此種子無菌播種萌發和植株形成研究極為重要。前人在對蘭科種子無菌播種和快速繁殖研究上，發現適宜的外源激素添加通過降低其促萌發的內源激素含量引起種子萌發[5]。同時，有機添加物因其富含多種營養成分，具有為植物生長提供一些生理活性物和補充未知微量成分的作用，已有運用于蘭科植物的研究[6]。通過研究基礎培養基添加外源激素、香蕉泥、椰子汁和活性炭組合發現，椰子汁比香蕉泥更易于石橄欖種子萌發和幼苗形成，同時，結合外源激素添加更能促進石橄欖種子萌動，促進細胞分裂和幼苗分化。雖然活性炭對于石橄欖種子前期的萌動有促進作用，但是后期的幼苗分化能力較為不足，可能是由于活性炭能夠提供暗環境和吸附培養基中有害物質（如醌類化合物）的同時，也能吸附離體培養中的生長調節物和一些有益的營養物[7]。

在石橄欖的增殖培養中發現，在基本培養基中添加細胞分裂素6-BA和生長素NAA組合起到關鍵性作用。適宜濃度的6-BA和低濃度的NAA組合能夠促進植物側芽形成、分化和增殖，這可能是因為石橄欖增殖種苗內源激素較低，需外源添加適宜的植物生長調節劑促進其側芽的形成、分化和增殖。但當6-BA濃度較高和NAA濃度較高時，都不利于側芽的形成、分化和增殖，這可能是由于石橄欖增殖種苗在增殖培養過程中吸收并累積過多外源激素所致。因此，石橄欖在側芽形成、分化和增殖過程中，6-BA和NAA存在交互作用，這與許多植物組織培養報道結果一致[8]。此外，在植物組織培養階段，假鱗莖的形成有利于植物壯苗生根，進而提高種苗質量和移栽成活率。研究發現低濃度的NAA有利于植株假鱗莖的形成，而高濃度下假鱗莖形成數較少，適宜濃度的6-BA和NAA組合有利于促進植物側芽形成、分化和增殖以及植株假鱗莖的形成。

該研究以石橄欖種子為外植體，研究不同濃度6-BA、NAA、有機添加物組合，篩選了適宜的誘導、增殖及壯苗生根培養基配方，建立了一套石橄欖種子無菌播種和快速繁殖技術體系，對于石橄欖野生種質資源保護、繁殖周期縮短、供應優質種苗具有重要意義。

參考文獻

[1]

翁水旺.石仙桃的研究進展[J].中國現代中藥，2006，8（6）：35-36.

[2] 王蓮輝，姜運力.尖葉石仙桃的胚培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2006，42（5）：136.

[3] 胡明芳.福建藥用蘭科植物資源保護與可持續利用[J/OL].（2012-02-27）[2016-10-11].http：//wenku.baidu.com/view/23081cefe009581b6bd9eb50.ht mL.

[4] 易綺斐，邢福武，陳紅鋒，等.我國石仙桃屬植物的分布和開發利用[J].華南農業大學學報，2004，25（3）：94-97.

[5] 周輝明，林輝鋒，尚偉，等.垂花蕙蘭種子無菌播種和快速繁殖[J].福建農業學報，2013，28（10）：981-986.

[6] 李亮，張冬梅，雷華輝，等.植物組織培養中有機添加物應用研究[J].寧夏農林科技，2012，53（2）：28-30，34.

[7] 劉根林，梁珍海，朱軍.活性炭在植物組織培養中的作用概述[J].江蘇林業科技，2001，28（5）：46-48.

[8] 黎海利，譚飛理，劉鍇棟，等.聚花過路黃的組織培養和快速繁殖[J].江蘇農業科學，2015，43（6）：51-53.