泰國(guó)斗魚玈ox9基因的克隆及組織表達(dá)研究

賀超 洪廣 吳靜嫻 馮正陽(yáng) 王文基 陳華譜 朱春華 李廣麗

摘要[目的]克隆性別調(diào)控基因Sox9的cDNA序列，為后續(xù)開展Sox9分子進(jìn)化及性別調(diào)控功能的研究提供參考。[方法]從泰國(guó)斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長(zhǎng)，并展開序列分析及在雌雄個(gè)體中的組織分布研究。[結(jié)果]利用Smart-RACE的分子克隆方法，從泰國(guó)斗魚精巢中克隆得到Sox9基因的cDNA序列，全長(zhǎng)為2 201 bp，其中開放讀碼框1 449 bp；氨基酸比對(duì)分析顯示Sox9氨基酸序列中的HMG序列的保守性相當(dāng)高；通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)泰國(guó)斗魚Sox9與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近；利用RT-PCR的方法檢驗(yàn)了泰國(guó)斗魚Sox9基因在雌雄個(gè)體中的組織分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰國(guó)斗魚Sox9基因在雌性的肌肉中表達(dá)量最高，其次在腦和腸中，而在卵巢未檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)；在雄性中，Sox9基因在腦和精巢中的表達(dá)量最高。[結(jié)論]泰國(guó)斗魚Sox9具有保守的結(jié)構(gòu)特征，并且在組織分布中顯示出表達(dá)特異性及性別差異性。

關(guān)鍵詞泰國(guó)斗魚；Sox9；序列分析；組織分布

中圖分類號(hào)S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0151-05

Study on Cloning and Tissue Expression of Sox9 in Betta splendens

HE Chao，HONG Guang，WU Jingxian，CHEN Huapu* et al（Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA sequence of sexual regulation gene Sox9 ，to provide a basis for the molecular evolution and functional studies of Sox9 in Betta splendens.[Method]The Sox9 cDNA sequence in B.splendens was cloned.Sequence analysis and research of organizations distribution in the male and female individual was carried out.[Result]The Sox9 cDNA sequence in the testis of B.Splendens was cloned by using the rapidamplification of cDNA ends （RACE），it contained 2 201 bp nucleotides with the open reading frame （ORF） of 1 449 bp；the amino acid sequence alignment showed that the HMG （the high mobility group box） domain of Sox9 was rather conserved； based on the phylogenetic analysis，the B.splendens Sox9 protein was closer to Cynoglossus semilaevis；tissue distribution analyzed by RTPCR showed that the expressions of Sox9 were highly expressed in muscle，moderate in brain and gun，and undetectable in ovary in female； high expression level of Sox9 was found in testis and brain in male.[Conclusion]The Sox9 in B.Splendens shows conservative structural characteristics，tissue express specificity and gender differences.

Key wordsBetta splendens；Sox9；Sequence analysis；Tissue distribution

Sox（SRYrelated high mobility group box）家族目前已經(jīng)被克隆鑒定出30多個(gè)成員。Sox家族成員均含有79個(gè)高度保守HMG盒（high mobility group box）的結(jié)構(gòu)域，主要是與下游調(diào)控基因的DNA結(jié)合，成為Sox家族成員的最顯著性結(jié)構(gòu)特征[1]。其中Sox9被認(rèn)為是Sox家族中與性別分化較相關(guān)的成員之一[2]，受到了廣泛的關(guān)注與研究。在哺乳類、鳥類和爬行類的性分化時(shí)期，Sox9基因在雄性生殖嵴的表達(dá)量急劇上調(diào)[3-5]。在小鼠中，雌性性腺中Sox9的異常表達(dá)導(dǎo)致了睪丸的形成[6]。Sox9基因的缺失會(huì)造成雄性逆轉(zhuǎn)成為雌性，從而表明Sox9基因在精巢發(fā)育中起了至關(guān)重要的作用，并被認(rèn)為是雄性性別決定因子[7]。但在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠卵巢中，Sox9在卵泡發(fā)育過(guò)程中同樣扮演著重要的調(diào)控角色，顯示出Sox9在雌雄發(fā)育調(diào)控中的雙重生理功能[8]。

魚類的性腺發(fā)育具有多種形式，如雌雄異體、雌雄同體、先雌后雄和先雄后雌等。魚類多樣化的發(fā)育模式為研究性別分化機(jī)制提供了更加理想的模型。Sox9作為公認(rèn)的性別分化調(diào)控因子之一，在魚類研究中同樣受到了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)在斑馬魚（Danio rerio） [9]、 鱔魚（Monopterus albus）[10]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss） [11]、青鳉（Oryzias latipes）[12]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides） [13]、大西洋鱈魚（Gadus morhua） [14]、金錢魚（Scatophagus argus） [15]和胡子鯰 （Clarias batrachus） [16]等魚類中展開研究，證實(shí)Sox9在魚類性別分化中發(fā)揮著重要的作用。但由于魚類屬于低等的脊椎動(dòng)物，易受外界因子的影響，導(dǎo)致性別的可塑性較高，因此需要在更多的魚類中進(jìn)行拓展研究，才能更好地從差異中獲得共性結(jié)果，從而更好地闡述Sox9基因在魚類中的性別調(diào)控功能。

泰國(guó)斗魚（Betta splendens）原產(chǎn)于泰國(guó)，又被稱為彩雀魚，是一種重要的熱帶小型淡水物種，同時(shí)是一種被廣泛養(yǎng)殖的觀賞魚。泰國(guó)斗魚雌雄個(gè)體差異十分明顯，雄性天生好斗，色彩豐富多樣，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，價(jià)格便宜，易于飼養(yǎng)，是一種研究魚類生理功能的理想模型。目前對(duì)泰國(guó)斗魚的分子生物學(xué)研究較少，筆者以泰國(guó)斗魚為研究對(duì)象，利用現(xiàn)代分子克隆的技術(shù)方法，從泰國(guó)斗魚的精巢中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長(zhǎng)，并開展了Sox9基因相關(guān)序列的結(jié)構(gòu)分析及組織表達(dá)分布研究，為深入闡明Sox9基因在泰國(guó)斗魚中的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)魚試驗(yàn)用魚（泰國(guó)斗魚）購(gòu)于廣東省湛江市霞山區(qū)花鳥市場(chǎng)。試驗(yàn)中，將泰國(guó)斗魚置于冰上麻醉，等其失去知覺后，將其肌肉、性腺、腦、垂體、心臟、肝、腎、脾、腸等組織或器官取出，液氮速凍，然后保存于-80 ℃ 超低溫冰箱中備用。

1.2試劑

總RNA提取試劑Trizol Reagent購(gòu)于Life公司； DNase Ⅰ和the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)于TOYOBO公司；Smart-RACE試劑盒購(gòu)于TaKaRa Clontech公司；Taq酶和載體pTZ7R/T購(gòu)于MBI Fermentas公司； 質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購(gòu)于廣州東盛公司；化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3序列比對(duì)與引物設(shè)計(jì)

通過(guò)NCBI 基因庫(kù)的序列搜索比對(duì)，找出與泰國(guó)斗魚Sox9序列同源性最高的魚類Sox9序列。通過(guò)比對(duì)分析，根據(jù)序列的保守結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出用于泰國(guó)斗魚Sox9基因克隆與組織表達(dá)分析等的引物（表1）。

1.4總RNA提取

根據(jù)Trizol reagent試劑盒說(shuō)明書的要

求操作，獲得泰國(guó)斗魚各組織的總RNA。總RNA的濃度和完整性分布利用核酸測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5分子克隆

以泰國(guó)斗魚精巢的總RNA作為模板，利用the ReverTraAce-a first-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成克隆Sox9中間片段的cDNA模板，并通過(guò)中間片段克隆引物的擴(kuò)展，克隆獲得泰國(guó)斗魚Sox9基因的cDNA中間片段序列。然后根據(jù)中間片段，設(shè)計(jì)5′和3′Race的特異克隆引物。根據(jù)Smart-RACE試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行克隆，分別獲得泰國(guó)斗魚Sox9基因5′和3′端的序列，然后通過(guò)拼接，獲得cDNA序列全長(zhǎng)。最后通過(guò)全長(zhǎng)特異引物驗(yàn)證，獲得確切的Sox9 cDNA序列全長(zhǎng)。

1.6序列分析

利用DNAtool6.0軟件分析泰國(guó)斗魚Sox9基因的cDNA序列，確定其開放讀碼框（Open Reading Frame，ORF）并推導(dǎo)氨基酸序列，用 ProtParam 軟件預(yù)測(cè)蛋白分子量及理論等電點(diǎn)等參數(shù)。使用Clustalx1.8進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，并用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7組織分布從各個(gè)組織的總RNA中吸取1 μg，用DNase Ⅰ將基因組DNA去除，然后根據(jù)第一鏈cDNA合成的說(shuō)明書合成cDNA模板。利用泰國(guó)斗魚Sox9基因的特異引物與β-actin基因作為內(nèi)參，進(jìn)行組織分布的半定量檢測(cè)。試驗(yàn)所用的反應(yīng)體系為25 μL，循環(huán)條件為 94 ℃預(yù)變性4 min；接著94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1 min，吸取8 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用天能Tanon2500R凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照與半定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1泰國(guó)斗魚Sox9基因的cDNA序列全長(zhǎng)

利用DNAStar軟件去除載體序列并將其進(jìn)行拼接，得到泰國(guó)斗魚Sox9完整的cDNA序列。泰國(guó)斗魚Sox9 cDNA全長(zhǎng)為2 201 bp，包括 5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）109 bp，3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）554 bp，開放閱讀框（ORF）為1 449 bp（圖1）。其中在第104～172 aa之間為Sox9 HMG-box，在該盒內(nèi)存在1個(gè)特征性基序AQAARRKL，2個(gè)核定位信號(hào) NLS（NLS1：KRPMNAFMVWAQAARRK；NLS2：RRRK）。用 ProtParam 軟件預(yù)測(cè)泰國(guó)斗魚Sox9 蛋白分子量為 52.972 kD，理論等電點(diǎn)為 6.23。

2.2泰國(guó)斗魚Sox9的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析 將泰國(guó)斗魚Sox9與已知魚類的Sox9序列進(jìn)行同源性分析（圖2），結(jié)果顯示泰國(guó)斗魚Sox9蛋白前體和其他魚類的Sox9蛋白類似，均具有Sox家族的特征性結(jié)構(gòu)。 泰國(guó)斗魚Sox9蛋白前體中的HMG結(jié)構(gòu)域和其他魚類HMG結(jié)構(gòu)域同源性較高，顯示出高度的保守性，只有1個(gè)氨基酸殘基的差異。另外，在HMG結(jié)構(gòu)域內(nèi)同樣存在1個(gè)特征性基序AQAARRKL，以及2個(gè)核定位信號(hào)NLS1和NLS2。

2.3泰國(guó)斗魚Sox9系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用鄰位相連算法構(gòu)建泰國(guó)斗魚以及其他脊椎動(dòng)物Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 3），結(jié)果顯示泰國(guó)斗魚的Sox9蛋白與其他魚類聚為一簇，其中與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近，其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等，與雞、小鼠和人類等高等脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4泰國(guó)斗魚Sox9基因的組織分布

利用RT-PCR半定量的方法分析Sox9基因在泰國(guó)斗魚雌雄個(gè)體不同組織中的表達(dá)情況。在雌性中，Sox9在肌肉中的表達(dá)量最高，其次為腦和腸組織，在腎臟和胃檢測(cè)到較低的表達(dá)量，在垂體中檢測(cè)到微弱的表達(dá)信號(hào)，在肝臟、卵巢和心臟中均檢測(cè)不到表達(dá)信號(hào)。在雄性中，Sox9在腦和精巢中的表達(dá)量較高，其次是腎臟和肌肉，在垂體、肝臟、腎臟、心臟和腸中均未檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)。

3結(jié)論與討論

通過(guò)現(xiàn)代分子克隆技術(shù)方法，克隆獲得泰國(guó)斗魚Sox9基因的cDNA序列全長(zhǎng)。通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)泰國(guó)斗魚的Sox9與其他魚類的Sox9蛋白一樣，具有Sox家族成員典型的HMG結(jié)構(gòu)，并且顯示出高度的保守性[1]。泰國(guó)斗魚Sox9蛋白與其他魚類的Sox9蛋白序列長(zhǎng)度和大小相似，并均具有Sox9因子其他的重要結(jié)構(gòu)特征，如2段核定位信號(hào)序列NLS1和NLS2，及HMG區(qū)域中的特征基序（AQAARRKL）[1-2]。這些基序的高度保守，表明了Sox9蛋白在結(jié)構(gòu)進(jìn)化過(guò)程中的保守性，同時(shí)也預(yù)示著生理功能在進(jìn)化過(guò)程中的保守。

利用鄰位相連算法進(jìn)一步分析泰國(guó)斗魚及其他脊椎動(dòng)物Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，泰國(guó)斗魚與半滑舌鰨的親緣關(guān)系最近，其次是尖吻鱸、斜帶石斑魚、金錢魚和黃鱔等魚類，而與同為鱸形目的羅非魚和海鱸的親緣關(guān)系比其他目的魚類還要遠(yuǎn)，從而顯示出Sox9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化與物種的進(jìn)化地位不相一致。這可能與魚類的基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)。魚類基因組在進(jìn)化過(guò)程中，經(jīng)歷了3次基因組復(fù)制，導(dǎo)致很多基因發(fā)生了多亞型化，一般會(huì)同時(shí)存在2種或幾種亞型。已經(jīng)在多種魚類中發(fā)現(xiàn)了Sox9基因存在2種亞型[9-10，12]，分別是Sox9a和Sox9b。由于多亞型的存在，可能會(huì)導(dǎo)致Sox9蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建中聚類發(fā)生改變。后續(xù)需要在更多物種中拓展研究，將Sox9的各個(gè)亞型進(jìn)行克隆鑒定，才能進(jìn)一步完善Sox9蛋白分子的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)了泰國(guó)斗魚在雌雄個(gè)體中的組織分布情況，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)泰國(guó)斗魚Sox9基因具有顯著的組織表達(dá)特異性和雌雄差異性，預(yù)示了Sox9具有多種生理調(diào)節(jié)功能及雌雄功能的差異。泰國(guó)斗魚的組織分布和其他魚類一樣，均具有組織表達(dá)特異性及雌雄差異性[9-10，12]。在雌性泰國(guó)斗魚中，Sox9 mRNA在腦中的表達(dá)量均較高，與金錢魚[15]、虹鱒[11]、斜帶石斑[13]和鯰魚的研究相一致，表明Sox9在上游神經(jīng)系統(tǒng)中的重要生理功能。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)Sox9基因在精巢中具有高表達(dá)，而在卵巢中檢測(cè)不到表達(dá)信號(hào)，這與胡子鯰[16]和斑馬魚[17]Sox9a基因的表達(dá)情況相一致，從而表明泰國(guó)斗魚Sox9在雄性發(fā)育中具有十分重要的作用，并可能和其他物種一樣，起到性別決定的作用。后續(xù)需要開展更多的研究，進(jìn)一步闡明泰國(guó)斗魚Sox9基因在性別調(diào)控中的確切功能。

該研究從泰國(guó)斗魚中克隆鑒定出Sox9基因的cDNA序列全長(zhǎng)，并展開了序列分析及在雌雄個(gè)體中的組織分布檢測(cè)。序列分析結(jié)果表明，泰國(guó)斗魚Sox9具有保守的結(jié)構(gòu)特征，并且在組織分布中顯示出表達(dá)特異性及性別差異性。這為深入探討Sox9基因的分子進(jìn)化及生理功能奠定了研究基礎(chǔ)。

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