江蘇省漁源性嗜水氣單胞菌耐藥性分析

劉訓猛 方蘋 陳靜 袁銳 吳亞鋒 習丙文

摘要[目的]對江蘇省漁源性嗜水氣單胞菌進行耐藥性分析。[方法] 2014—2015年，對江蘇地區漁源性嗜水氣單胞菌進行流行病學調查，用API20E試劑條檢測嗜水氣單胞菌，采用紙片擴散法進行耐藥性分析。[結果]共檢測到嗜水氣單胞菌陽性菌株92份，陽性率為17.79%。對92株嗜水氣單胞菌的藥敏試驗結果表明，在耐藥率方面，利福平、新霉素的耐藥率>36%，羅紅霉素的耐藥率>23%，諾氟沙星、慶大霉素、恩諾沙星的耐藥率>10%，卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素的耐藥率<9%。在高敏性方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、鏈霉素>80%，諾氟沙星、利福平、慶大霉素、恩諾沙星>70%，紅霉素<30%，新霉素<10%。[結論]在江蘇地區嗜水氣單胞菌的藥物防控中，首選藥物為氧氟沙星、卡那霉素和鏈霉素，應盡量避免使用利福平、新霉素和羅紅霉素。

關鍵詞嗜水氣單胞菌；抗生素；耐藥性

中圖分類號S941文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）08-0110-05

Analysis on Drug Resistance of Fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province

LIU Xunmeng1，FANG Ping1，CHEN Jing1，XI Bingwen2* et al

（1.Jiangsu Center for Control and Prevention of Aquatic Animal Infectious Disease in Jiangsu Province，Nanjing，Jiangsu 210036；2.Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi，Jiangsu 214081）

Abstract[Objective] To analyze the drug resistance of fisherysource Aeromonas hydrophila in Jiangsu Province. [Method] The epidemiological investigation was made on fisherysource A. hydrophila in Jiangsu Province during 2014-2015. A. hydrophila was detected by using API20E reagent strip. And their drug resistance was detected by using disc diffusion method. [Result] 92 positive strains of A. hydrophila were detected，the positive rate was 17.79%. The results of drug sensitivity test of 92 strains of A. hydrophila showed that the drug resistant rate of rifampin and neomycin were over 36%. The drug resistant rate of roxithromycin was more than 23%. The drug resistance rate of norfloxacin， gentamycin， enrofloxacin were lower than 10%. The drug resistant rate of kanamycin， ofloxacin， erythromycin were lower than 9%. From the hypersensibility，the hypersensibility of ofloxacin was more than 90%，the hypersensibility of kanamycin and streptomycin were more than 80%，the hypersensibility of norfloxacin， rifampicin， gentamycin and enrofloxacin were more than 70%，the hypersensibility of erythromycin was lower than 30%，and the hypersensibility of neomycin was lower than 10%. [Conclusion] In drug prevention and control of A. hydrophila in Jiangsu Province，the preferred drugs were ofloxacin， kanamycin and streptomycin. Rifampin， neomycin and roxithromycin should be avoided to use.

Key wordsAermomnas hydrophila；Antibiotics；Drug resistance

嗜水氣單胞菌（Aermomnas hydrophila）為革蘭氏陰性桿菌，在世界各地自然環境中分布較為廣泛[1-3]。嗜水氣單胞菌在被分離發現的初期，因其非主要致病菌而被忽略。近幾十年，嗜水氣單胞菌引起人、畜、魚致病的案例屢見報道，因而受到人類醫學、畜牧醫學和水產醫學界的重視。在人類醫學臨床上，嗜水氣單胞菌可以導致肝膽疾病及惡性腫瘤等免疫功能低者感染發病，且病死率很高[4-5]。在水產養殖中，嗜水氣單胞菌可引起多種水生動物的傳染病。國內外已有學者做了相關研究報道，從發病的鳊魚體[6]、急性發病的斑點叉尾鮰[7]、發病的羅非魚[8]、發病的歐鰻[9]、發病的黃鱔[10]等體內分離的病原均被鑒定為嗜水氣單胞菌。其他國內主要魚類養殖品種，包括兩棲類的牛蛙[11]、觀賞類的金錢魚[12]、甲殼類的小龍蝦[13]等亦均有報道。筆者以2014—2015年江蘇地區養殖漁源性嗜水氣單胞菌的流行病學調查為基礎，進行分離菌株的藥敏試驗，分析分離菌株的耐藥性和高敏藥物，以期為江蘇漁源性嗜水氣單胞菌的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

普通營養肉湯培養基、普通營養瓊脂培養基、堿性胨水培養基、MH瓊脂培養基、藥敏紙片，均購自杭州天和生物試劑公司；API20E細菌生化鑒定試劑條由法國梅里埃公司生產。

1.2方法

1.2.1采樣。

2014—2015年從江蘇省12個縣（市、區）每個縣（市、區）各選取2個重點養殖廠或養殖戶（養殖廠、養殖戶的選擇以典型品種、養殖面積及品種差異化等原則為主）。每年的3—10月中旬在樣品點進行活體采樣，未發病的樣品點每個樣品采樣5～10尾，發病樣品每個樣品采樣3～5尾，在發病期將每30 d 1次的采樣頻次增加到每10～15 d采樣1次。共采集樣品517份，調查的主要養殖品種有異育銀鯽（103份）、草魚（77份）、鳙魚（36份）、鰱魚（31份）、鯉魚（8份）、鳊魚（39份）、鱸魚（12份）、斑點叉尾鮰（15份）、河蟹（83份）、小龍蝦（37份）、青蝦（26份）、南美白對蝦（24份）和羅氏沼蝦（26份）。調查的主要采樣地點有金壇（40份）、江寧（40份）、通州（39份）、泗洪（35份）、句容（34份）、寶應（43份）、江都（47份）、姜堰（35份）、興化（49份）、常熟（54份）、大豐（52份）和新沂（49份）。

1.2.2病原分離與鑒定。

將采樣樣品用75%乙醇體表消毒后進行解剖，無菌采集肝、脾、腎（約0.1 g）及血液和腹腔積液0.1 mL，置于堿性胨水培養液，30 ℃恒溫下24 h培養后，各取1接種環培養液置于普通營養瓊脂培養基平板上，劃線，30 ℃恒溫下24 h培養，挑選表面光滑微凸、無色或淡黃色菌落進行純化。將純化的菌株轉接至普通營養瓊脂斜面，4 ℃下保存備用。然后，用API20試劑條進行細菌鑒定。

1.2.3藥敏試驗。

采用Kirby-Bauer紙片擴散法，對分離并鑒定的嗜水氣單胞菌開展10種漁業常用抗菌類藥物的敏感性測定，藥敏試驗具體操作按照抗菌藥物敏感性試驗執行標準（CLSI/NCCLS-M100-S22 ）[14]方法操作。

從普通營養瓊脂培養基上挑取已純化的菌落，接種于LB液體培養基中30 ℃過夜培養后，用生理鹽水將其濃度校正至0.5麥氏標準。然后，用無菌棉蘸取菌液，將管內壁多余菌液旋轉擠去后，在瓊脂表面均勻涂布接種3次，最后沿平板內緣涂抹。將平板在37 ℃下放置5～10 min后，用鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面上，各紙片的距離不小于24 mm，每個平板貼3片，培養24 h后記錄藥敏圈直徑。1.2.4溶血試驗。

將92株嗜水氣單胞菌，用普通營養瓊脂培養基進行復蘇培養，劃線于血瓊脂培養基上，30 ℃下恒溫培養24 h，觀察各陽性菌株對血瓊脂培養基的溶血狀況。

2結果與分析

2.1病原分離和鑒定

采用API20E細菌生化鑒定試劑條對采集樣品進行鑒定，共分離并純化嗜水氣單胞菌目標菌株92份。檢測結果表明，陽性樣品92份，陽性率為17.79%。從采樣地分布來看，92株陽性菌株分別來源于金壇（4份）、江寧（6份）、通州（6份）、泗洪（4份）、句容（5份）、寶應（7份）、江都（7份）、姜堰（9份）、興化（14份）、常熟（6份）、大豐（16份）和新沂（8份）。從圖1可以看出，各采樣地區分離菌株的陽性率為10.00%～30.77%，其中姜堰、興化和大豐地區分離菌株的陽性率較高，均大于25.00%。

從采樣品種來看，92株陽性菌株分別來源于異育銀鯽（35份）、草魚（17份）、鳙魚（1份）、鰱魚（6份）、鯉魚（1份）、鳊魚（2份）、鱸魚（2份）、斑點叉尾鮰（4份）、河蟹（12份）、小龍蝦（3份）、青蝦（4份）、南美白對蝦（2份）和羅氏沼蝦（3份）。從圖2可以看出，各采樣品種分菌菌株的陽性率

2.3藥敏試驗

試驗選用10種藥敏紙片，測定分離菌株對其藥物敏感性和耐藥性。由表2可知，92株嗜水氣單胞菌對氨基糖苷類、喹諾酮類、大環內酯類都有耐藥株。在耐藥性方面，諾氟沙星、卡那霉素、利福平、羅紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、鏈霉素、紅霉素、恩諾沙星、新霉素的耐藥率分別為

13.04%、8.69%、45.65%、23.91%、10.87%、6.52%、10.87%、5.43%、11.96%和36.96%，其中利福平和新霉素的耐藥率大于36%，羅紅霉素的耐藥率大于23%，諾氟沙星、慶大霉素、恩諾沙星的耐藥率大于10%，卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素的耐藥率小于9%（圖3）。

在高度敏感藥物篩選方面，10種抗生素對92株嗜水氣單胞菌的高敏性為：諾氟沙星77.17%、卡那霉素81.52%、利福平73.91%、羅紅霉素50.01%、慶大霉素79.34%、氧氟沙星93.48%、鏈霉素80.43%、紅霉素28.27%、恩諾沙星78.25%、新霉素9.79%。

3討論與結論

抗生素產生耐藥性主要有以下危害：①抗生素療效下降，導致后續劑量加大和用藥期延長的惡性循環；②產生耐藥性轉移，這些殘留的抗生素通過農產品，發生藥物轉移到最終的消費者，日積月累地蓄積在消費者體內，造成對人體病原菌的慢性刺激，誘發人類病原菌對某些抗生素的耐受性；③另一種耐藥性轉移，消費者食用含有耐藥菌的農產品，這些細菌（即使是已經烹飪殺死的耐藥細菌），所攜帶的β-質粒，可以將對某種抗生素的耐藥性傳遞和轉移給人類體內的某些致病菌群，從而導致人類被耐藥現象，這就是耐藥性的種間轉移。藥物敏感性檢測，可以指導漁民精準用藥，有效解決水產養殖中抗生素濫用問題，減緩抗生素耐藥性產生的進程。

對不同地區、同屬不同種的細菌進行藥敏試驗，可以指導地區從業者有針對性地使用抗生素。筆者對江蘇省重點漁業養殖地區、養殖品種中檢測到嗜水氣單胞菌進行藥敏試驗，結果表明2014—2015年分離的嗜水氣單胞菌對氨基糖苷類、喹諾酮類、大環內酯類均有耐藥株。對卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素耐藥率<9%，可作為治療水產養殖嗜水氣單胞菌病害的防治用抗生素。利福平、新霉素、對羅紅霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、慶霉素的耐藥率>10%，其中對利福平和新霉素的耐藥率>36%。10種抗生素耐藥性檢測中有70%的抗生素耐藥率大于7%，耐藥率高于國外文獻報道[15]結果，與國內人類醫學臨床檢驗報道結果[16]基本吻合，可能與抗菌藥的廣泛應用有關，應引起國內研究者的重視。在高敏藥物篩選方面，氧氟沙星>90%，卡那霉素、鏈霉素>80%，諾氟沙星、利福平、慶大霉素、恩諾沙星>70%，紅霉素<30%，新霉素<10%。在江蘇地區嗜水氣單胞菌的藥物防控中，首選藥物為氧氟沙星、卡那霉素和鏈霉素，應避免利福平、新霉素和羅紅霉素的使用。

嗜水氣單胞菌分泌的外毒素（Aer）具有細胞裂解性，能引起大多數嗜水氣單胞菌產α或β溶血。龔暉等[17]對嗜水氣單胞菌Aer溶血特性進行了分析，證實了在單因子條件下嗜水氣單胞菌的溶血特性存在一定的差異，嗜水氣單胞菌中存在多種溶血性毒素，這些毒素對不同宿主的溶血能力存在差異，同一嗜水氣單胞菌菌株對不同宿主起主要作用的溶血性毒素不同。嗜水氣單胞菌引發的許多暴發性病害，多伴有敗血癥，嗜水氣單胞菌溶血性毒素的產生，導致了溶血、敗血癥狀。是否產生溶血素是嗜水氣單胞菌是否具有毒力及致病性的重要參考依據之一。嗜水氣單胞菌為條件致病菌，產生溶血素的嗜水氣單胞菌出現在機體內循環系統中，有時并不能立即致病。在外界環境出現劇烈變化的狀況下，一旦機體的免疫力下降達到臨界值，該菌產生的溶血毒素會成為暴發疾病的主要因子。該研究結果表明，此次分離的92株嗜水氣單胞菌有75%都可產生溶血現象。從江蘇地區分離的嗜水氣單胞菌，有很高的比例都可以產生溶血素，存在很高的致病風險。這就要求該地區一線養殖管理者，要切實做好池塘管理工作，通過提高環境質量、培育健壯魚種、投喂免疫增強劑等措施，提高養殖水產品的個體抗性。

參考文獻

[1] THAYUMANAVAN T，VIVEKANANDHAN G，SAVITHAMANI K，et al.Incidence of haemolysinpositive and drugresistant Aeromonas hydrophila in freshly caught finfish and prawn collected from major commercial fishes of coastal South India[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2003，36（1/2）：41-45.

[2] PARK Y H，LEE H C，SONG H G，et al.Recent increase in antibioticresistant microorganisms in patients with spontaneous bacterial peritonitis adversely affects the clinical outcome in Korea [J].J Gastroenterol Hepatol，2003，18（8）：927-933.

[3] 王玉，馮建軍，郭松林，等.嗜水氣單胞菌與遲頓愛德華氏菌二聯外膜蛋白的表達及其初步免疫原性[J].華中農業大學學報，2015，34（1）：96-102.

[4] CLARK N，CHENOWETH C E.Aeromonas infection of the hepatobiliary system：Report of 15 cases and review of the literature[J].Clin Infect Dis，2003，37（4）：506-513.

[5] 黃艷，韋小瑜，吳成梅，等.一起嗜水氣單胞菌引起的食物中毒調查[J].中國食品衛生雜志，2012，24（4）：391-393.

[6] 胡王，蔣啟歡，范騰飛，等.鳊魚出血病嗜水氣單胞菌的分離·鑒定與 ERIC-PCR 指紋圖譜研究[J].安徽農業科學，2012，40（4）：2056-2057.

[7] 李艷和，楊克禮，潘庭雙，等.安徽省斑點叉尾鮰細菌性病原的分離鑒定及藥物敏感性分析[J].安徽農業大學學報，2010，37（2）：278-283.

[8] 劉杰，龍宜楠，李大廣，等.羅非魚爛尾病病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗[J].廣西畜牧獸醫，2014，30（6）：316-319.

[9] 林天龍，陳日升，董傳甫，等.歐鰻嗜水氣單胞菌的分離、鑒定和特性分析[J].福建農業學報，2001，16（4）：35-40.

[10] 莊健，張治平，曾明華，等.黃鱔出血病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].長江大學學報（自然科學版），2016，13（3）：23-25.

[11] 劉訓猛，黃春貴，鄒勇，等.發病牛蛙病原鑒定及防治藥物篩選[J].河北漁業，2011（2）：41-44.

[12] 張慶華，馬文元，陳彪，等.嗜水氣單胞菌引致的金錢魚細菌性疾病[J].水產學報，2016，40（4）：634-643.

[13] 劉訓猛，趙宜清，陳靜.我國克氏原螯蝦病害及防治技術研究進展[J].中國水產，2013（10）：64-66.

[14] Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：Twentysecond informational supplement [S].Pennsylvania USA：CLSI，2012：44-50.

[15] KO W C，YU K W，LIU C Y，et al.Increasing antibiotic resistance in clinical isolates of Aeromonas strains in Taiwan[J].Antimicrob Agents Chemother，1996，40（5）：1260-1262.

[16] 曲芬，鮑春梅，崔恩博，等.氣單胞菌不同種的流行及耐藥性[J].中國抗感染化療雜志，2004，4（5）：302-305.

[17] 龔暉，林天龍，徐長安，等.嗜水氣單胞菌氣溶素的純化及其溶血特性分析[J].中國人獸共患病學報，2009，25（5）：422-425.