云南自然發酵酸菜液中乳酸菌的分離鑒定及其發酵性能研究

奎夢漪 薛橋麗 康嬌 胡永金

摘要[目的]對云南自然發酵酸菜液中的優勢乳酸菌進行分離、鑒定及發酵性能研究。[方法]從云南自然發酵酸菜液中分離出12株乳酸菌，經優選篩選出4株性狀優良的乳酸菌（S-3、S-6、S-8和S-10），通過形態學觀察及生理生化試驗對其進行鑒定，并研究其發酵性能。[結果]經鑒定，S-3和S-6為植物乳桿菌（Lactobacilllus plantarum），S-8為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），S-10為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。菌株S-6的發酵性能優良，產酸快，產酸量多，耐酸性較好，亞硝酸鹽降解性能高，pH 3時仍能較好地生長。[結論]該研究結果可為了解云南傳統酸菜發酵機制和控制酸菜發酵質量提供參考。

關鍵詞酸菜；乳酸菌；分離；鑒定；發酵性能

中圖分類號TS205.5文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0107-03

Isolation，Identification and Fermentation Performance of Lactic Acid Bacteria from Natural Fermented Sauerkraut Broth in Yunnan

KUI Mengyi1，XUE Qiaoli2，KANG Jiao3，HU Yongjin3*（1.School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650500； 2.Library of Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201； 3.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective] The isolation and identification of the dominant lactic acid bacteria in natural fermented sauerkraut in Yunnan were investigated，and the fermentation performance of the isolated strains was measured.[Method] 12 strains from the natural fermented sauerkraut broth in Yunnan were isolated，and four strains of lactic acid bacteria （S-3，S-6，S-8 and S-10） with the fine fermentation were screening out.According to their colony morphology，staining property and biochemical reaction characteristics，S-3 and S-6 are Lactobacilllus plantarum，S-8 is Leuconostoc mesenteroides and S-10 is Lactobacillus brevis. The strain S-6 has very good performance，such as fast acidforming，large acidoutput and high nitrite degradation capacity.At the same time，acid fastness of the strain S-6 shows the best among the 4 strains，which could grow very well under the condition of pH 3.[Conclusion] The results provide a reference for the fermentation mechanism of traditional sauerkraut and control the quality of the natural fermented sauerkraut in Yunnan.

Key wordsSauerkraut；Lactic acid bacteria；Isolation；Identification；Fermentation performance

酸菜是我國傳統的大眾型蔬菜發酵食品，其營養物質豐富、質感脆嫩、味道酸爽、色澤鮮亮、開胃提神、醒酒去膩，不但能增進食欲、幫助消化，還可以促進人體對鐵元素的吸收[1]，其汁液中也富含乳酸菌活菌，賦予酸菜多種營養保健功效[2-4]。酸菜也是云南蔬菜腌漬品中最主要的產品，但云南酸菜的生產依然是采用傳統的自然發酵方法，發酵周期相對較長，發酵過程中容易污染，產品質量不穩定，生產效率低下，并且亞硝酸鹽、食鹽的含量高，對人體存在潛在危害[5]。筆者從云南傳統發酵優良的酸菜中分離培養出優勢乳酸菌，采用形態學、生理生化鑒定手段對篩選到的優勢乳酸菌進行鑒定，并對其生理特性和發酵性能進行深入系統的研究，從中篩選出產酸快、同型乳酸發酵、具有特殊功能特性的優良乳酸菌菌株，旨在為促進云南酸菜這一傳統食品的現代化生產，縮短酸菜生產周期，降低生產成本，提高酸菜的產品質量、產品生產的技術含量和經濟效益奠定了理論基礎，為制備更優良、安全性高的云南發酵蔬菜制品提供更豐富的菌種資源和科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。酸菜：從云南通海普通家庭腌制酸菜中隨機采集20份成熟酸菜樣品；

培養基為MRS培養基。主要試劑：蛋白胨、酵母膏、吐溫-80、牛肉膏、瓊脂、乳酸。

1.1.2主要儀器設備。

精密pH計、AE100S電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱、HWS24D恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；UV1800紫外可見分光光度計；ZHJH-C1115B超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司。

1.2乳酸菌的分離與鑒定

1.2.1乳酸菌的分離篩選。

初篩：將不同酸菜樣品汁液分別用生理鹽水進行梯度稀釋，采用10倍梯度稀釋法，選擇適宜的稀釋度，涂布在乳酸菌初篩平板上，37 ℃下培養48 h，挑取碳酸鈣圈較大、培養基變黃的菌落。復篩：將初篩得到的菌株用接種針轉接到復篩試管內斜面培養基上，37 ℃下培養36 h，將斜面培養基顏色變化較大的菌株轉到平板培養基上純化，分離出單菌落。純化后的菌株于MRS斜面培養基中培養至對數生長期后置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2乳酸菌的鑒定。

①形態特征鑒定。菌落形態：觀察MRS平板培養基上單菌落形態，菌株革蘭氏染色。②產酸量測定。以酚酞作指示劑，采用氫氧化鈉堿液滴定法進行測定[6]。③產乳酸鑒定。采用紙層析乳酸定性試驗確定乳酸細菌[7]。④生理生化特性鑒定。參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行鑒定[8]。

1.3乳酸菌發酵性能分析

1.3.1乳酸菌生長特性測定。

供試菌株分別在無菌MRS培養液中活化2代，使菌株濃度達108 CFU/mL，以2%接種量接入滅菌的發酵培養基（蔬菜汁）中，在37 ℃下培養24 h，取發酵液2 mL 加入玻璃比色皿中，使用分光光度計在600 nm波長下測其吸光值，分析比較菌株的生長速率（μmax）和最大生長量（OD600）。

1.3.2產酸速率與產酸量測定。將

供試菌株分別在無菌MRS培養液中活化2代，使菌株濃度達108 CFU/mL，以2%接種量接入發酵培養基中（蔬菜汁），在37 ℃下培養24 h，分析比較菌株的最大產酸量（°T）。

1.3.3亞硝酸鹽降解率的測定。

將經活化2次的供試菌株按菌株濃度108 CFU /mL、2%的接種量接入10 mL 已滅菌的含有10 mg/kg NaNO2（分析純）的發酵培養基（蔬菜汁）中，在最適條件下培養24 h，采用鹽酸萘乙二胺法（GB 5009.33—2016）測定NaNO2含量，同時以未接種乳酸菌的蔬菜汁作為空白對照，重復3次。

1.3.4耐酸性能測定。

將經活化2次的供試菌株按菌株濃度108 CFU /mL、2%的接種量分別接種至pH 2.0、2.5、3.0和3.5的MRS液體培養基中，37 ℃培養2 h，分別取0和2 h的菌液傾注平板進行活菌計數，計算酸作用2 h的存活率。

2結果與分析

2.1乳酸菌的分離篩選經分離優選得到12株菌株，結果見表1。

由表1可見，菌株透明圈大小與產酸量呈正相關。在S-1～S-12各菌株中，以S-6菌株的透明圈直徑最大，達3.8 mm，產酸量最多，達2.98%；其次分別為S-3、S-10、S-8菌株，透明圈直徑均超過3.0 mm，分別為3.6、3.5和3.1 mm，產酸量分別為2.68%、2.58%和2.24%；S-1菌株透明圈和產酸量均最低。根據菌株透明圈大小與產酸量，以S-3、S-6、S-8和S-10菌株作為優選出的4個高產酸菌株開展后續試驗。

2.2乳酸菌的鑒定

2.2.1紙層析乳酸定性比較。

對乳酸標準溶液和S-3、S-6、S-8、S-10 4株菌株的發酵液進行比較，結果得發酵液的Rf值依次為0.736±0.002、0.729±0.004、

0.732±0.006、0.735±0.007、0.727±0.005。結果表明，S-3、S-6、S-8和S-

10菌株的發酵液中均含有乳酸，說明4個菌株均為產乳

酸菌株。

2.3菌株發酵性能研究

2.3.1生長速率與生長量。

對菌株生長量和生長性能進行測定以了解其生長周期及生長情況，S-3、S-6、S-8和S-10菌株的生長速率與生長量見表4。

可知，菌株S-3、S-6和S-10生長速率快，在蔬菜發酵前期其可以快速繁殖并成為發酵體系優勢菌群，這可抑制發酵過程中的雜菌生長，從而減少其有害代謝產物的積累。

2.3.2產酸量。各菌株的產酸速度和產酸量大小見圖1。從圖1可以看出，各菌株產酸量不斷增加，在生長過程中，乳酸菌快速繁殖產酸，使發酵液的pH 迅速下降。發酵過程中，酸度大小是

影響發酵蔬菜質量的重要因素之一，也是衡量乳酸菌性能優劣的重要參考依據。發酵48 h，S-6菌株具有最大的產酸量，其次分別為S-3和S-10菌株，產酸量最小的是S-8菌株。

2.3.3亞硝酸鹽降解能力。

不同種類乳酸菌降解亞硝酸鹽能力不同，即使同一種類的不同菌株之間降解亞硝酸鹽的能力也會有所差異，篩選降解亞硝酸鹽能力強的菌株，對于保證泡菜質量安全十分必要。S-3、S-6、S-8和S-10菌株降解亞硝酸鹽的能力見圖2。

可以看出，各供試菌株對亞硝酸鹽均有一定的降解能力。亞硝酸鹽降解率最高的為S-6菌株，降解率可以達85.8%；亞硝酸鹽降解率最低的菌株為S-8，降解率只有64.2%。

2.3.4耐酸性能。S-3、S-6、S-8和S-10菌株在不同酸性環境下的存活率如圖3所示。

由圖3可知，供試菌株在pH 3.5均具有較高的存活率，S-6菌株 2 h后存活率42.32%。但隨著pH的降低，各菌株存活率逐漸下降。在pH 2.0環境2 h后，存活率最高的仍是S-6菌株，為8.78%；存活率最低的菌株為S-8，為2.32%。

3結論

從云南自然發酵酸菜汁中分離得到12株產酸菌株。采用形態學觀察結合生理生化特性分析對S-3、S-6、S-8和S-10這4個高產酸菌株進行鑒定，S-3和S-6菌株為植物乳桿菌，S-8為腸膜明串珠菌，S-10為短乳桿菌。最終得出，S-6菌株具有優良的發酵性能。

參考文獻

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安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（8）：110-114