燕麥蛋白質近紅外定量模型的創建及其在育種中的應用

張麗君 劉龍龍 馬名川 崔林 周建萍

摘要[目的]研究利用近紅外光譜分析法定量分析燕麥完整籽粒粗蛋白含量的可行性，探討不同地區種植的同一燕麥品種蛋白質含量的變化，以期為燕麥的營養品質育種提供參考依據。[方法]收集蛋白質含量變幅較大的124份代表性燕麥樣品，利用近紅外谷物品質分析儀進行光譜掃描，采用常規化學分析方法（GB/T 5009.5—2010）測定樣品蛋白質含量，借助近紅外定標軟件WinISI，采用偏最小二乘法（PLS）建立燕麥粗蛋白含量的定標模型。利用定標模型對14個地區219份（17個品種）燕麥完整籽粒粗蛋白含量進行測定，分析不同地區、不同類型燕麥樣本間的差異。[結果]124份燕麥籽粒樣品的粗蛋白含量為15.49%～23.77%，分布范圍較廣，具有較好的代表性。成功建立了燕麥蛋白質含量的定標模型，決定系數較高，標準誤差較小，回歸方程具有較高的準確性。因此，利用近紅外光譜分析技術檢測燕麥籽粒中粗蛋白含量是可行且可靠的，可替代化學測定方法。[結論]近紅外光譜分析技術為檢測燕麥籽粒粗蛋白質含量提供了一種新方法。

關鍵詞燕麥；近紅外光譜；粗蛋白

中圖分類號S503文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0010-04

Establishment of Nearinfrared Quantitative Model for Protein in Oat and Its Application in the Breeding

ZHANG Lijun，LIU Longlong，MA Mingchuan，ZHOU Jianping* et al（Institute of Crop Germplasm Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops，Taiyuan，Shanxi 030031）

Abstract[Objective] To study the feasibility of quantitatively analyzing protein content in oat by using nearinfrared spectroscopy （NIRS） and discuss the changes of crude protein content in the same oat variety planted in different regions，to provide reference basis for improving the nutritional quality in the oats breeding.[Method] 124 representative oat samples with a broad range of crude protein content were collected to make spectral scanning by using nearinfrared grain quality analyzer.The contents of crude protein in samples were determined using traditional chemical method （GB/T 5009.5—2010）.By the aid of nearinfrared calibration software WinISI，the calibration model was established by using partial least square （PLS）method.The content of crude protein in 219 oat samples （17 varieties） was determined by using calibration model.The differences among different regions and different types were analyzed.[Result] The content of crude protein in 124 oat grain samples was 15.49%-23.77%，which had broader distribution range and good representativeness.The calibration model was successfully established with larger coefficient of determination and smaller standard error.The regression equation had a higher accuracy.Therefore，it was feasible and reliable to determine the content of crude protein in oat grains by using nearinfrared spectroscopy technique.Nearinfrared spectroscopy technique can replace chemical measurement method.[Conclusion]Nearinfrared spectroscopy technique provides a new method for determining the content of crude protein in oat grains.

Key wordsOat；Nearinfrared spectroscopy；Crude protein

燕麥起源于地中海、非洲以及中國，隸屬禾本科燕麥屬（Avena.L）一年生草本，集食用、飼用、藥用于一體，具有一定的醫療價值和保健作用，對于提高人類健康水平具有重要作用[1-2]。燕麥在我國已有2 100年的栽培歷史，是我國西南高寒山區和北方農牧地區的特色農作物。燕麥對自然條件惡劣、生態環境脆弱、土壤鹽堿化嚴重地區的適應能力較強，具有抗干旱、耐鹽堿的特性，對于改善生態環境具有重要意義[3]。與其他谷物相比，燕麥的蛋白質含量為13%～22%，脂肪含量為4%～16%，含有大量的不飽和脂肪酸[4-5]。燕麥已成為制作面包、點心、餅干的優質原料。隨著市場多樣化需求的不斷增加，燕麥在食品加工業、醫藥業、畜牧業等行業越來越顯示出重要作用。

蛋白質含量測定的常規方法主要是凱氏法（Kjeldahl），它是一個繁瑣、耗時、費力的破壞性分析法，在育種中難以及時準確地提供分析數據，一定程度上阻礙了燕麥蛋白質育種的研究進程。近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIRS）分析技術是新近發展起來的農產品高效分析法，是利用有機物質在近紅外譜區的振動吸收而快速測定樣品中多種化學成分含量的一項技術，其中透射譜區的近紅外光在樣品的穿透能力可達30 mm，適合整粒或原樣樣品分析[6-7]。近紅外光譜分析技術有常規分析法所難以比擬的許多優越性，已廣泛應用于農作物的水分[8]、蛋白質[9]、脂肪[10]、淀粉[11]、糖[12]等含量的測定，其中水稻[13]、大豆[14]、玉米[15]等大宗作物品種分析的報道較多。近紅外光譜技術能有效改變燕麥蛋白質育種進展緩慢的不利局面，目前利用完整燕麥籽粒的研究報道卻很少。陳龍等[16]、趙秀芳等[17]通過近紅外光譜對燕麥干草蛋白質進行分析。筆者采用近紅外透射技術，利用全息數字光柵進行全譜掃描，對燕麥粗蛋白含量進行了測定，并分析不同地區燕麥蛋白質與產地之間的關系，旨在為燕麥種質資源的篩選、鑒定及收集、利用尋找一種準確、簡便、有效的分析手段。

1材料與方法

1.1材料試驗材料包括2個部分，分別用于蛋白質含量預測模型建立和育種材料的預測篩選。一部分來自山西種質資源中期庫保存蛋白質含量變幅較大的124份代表性燕麥樣品（來源地信息見表1），這些材料的蛋白質含量和11個農藝性狀（單株粒重、千粒重、生育期、株高、幼苗習性、幼苗顏色、有效分蘗、旗葉葉相、穗形、小穗形、內稃色）均有較大差異，因此具有較好的代表性； 另一部分來自燕蕎麥現代產業技術體系2011年全國燕麥新品種展示試驗的14個區試點（地名、經緯度、海拔、降水量見表2）的219份燕麥籽粒17個燕麥品種（白燕2號、蒙燕833-1-1、冀張莜12號、冀品1號、寧莜1號、壩莜12號、壩莜13號、燕2009、白燕11號、冀張燕5號、定燕1號、壩燕5號、冀鑒001、V9、冀張燕3號、壩燕6號、9642-4），用于蛋白質含量的檢測。

1.2方法

1.2.1樣品制備。

選取適量的樣品，去除雜質以及病、霉籽粒，用于樣品光譜的采集；用FOSS的旋風磨（Cyclotec1093）將已經掃過光譜的樣品（建模材料）制成粉狀，用于常規粗蛋白的測定。

1.2.2光譜測定。樣本經風選除雜，在瑞典 FOSS-Tecator的InfratecTM 1241型近紅外光譜儀上進行光譜掃描，將燕麥籽粒置于樣品池中。在光程18 mm下掃描光譜，采集樣品的吸收光譜；為了克服樣品粒度差異引起的光譜漂移[18]，減少誤差，每份樣品重復取樣2次，每次取樣掃描2個光譜（重復裝樣獲得光譜），2次重復4個光譜，得到 1 條平均近紅外光譜圖，通過分析儀適配器轉換，把每個光譜數據儲存于計算機內，并使用 FOSS 公司提供的近紅外專業定標軟件（WinISI）對光譜進行分析。

1.2.3燕麥籽粒粗蛋白含量的測定。

粗蛋白含量測定按照國家標準（GB 5009.5—2010）中凱氏法[19]進行。標準樣品是用全麥粉粗蛋白質標準物質[GBW（E）100126]，利用FOSS的全自動凱氏定氮儀（Kjeltec8400）測定粗蛋白含量；每個樣品重復測定 2 次，求出2次重復測定結果的平均值。常規分析數據為化學值，近紅外分析數據為預測值。

1.2.4建立NIRS模型。

利用WINSIⅢ軟件，對采集的光譜數據進行標準正常化和去散射處理，導數光譜分別采取一階導數和二階導數處理，利用主成分分析（PCA） 技術自動剔除超常樣品，并選擇具有代表性的樣品，采用最小二乘法回歸（Partial least square，PLS）法建立燕麥粗蛋白的定標模型。

1.2.5定標模型在育種中的應用。

使用近紅外分析儀對14個地區219份燕麥籽粒17個燕麥品種籽粒粗蛋白含量進行測定。所有樣品重復測定3次，取其平均值。

2結果與分析

2.1燕麥籽粒中蛋白質含量的化學測定

采用國家標準（GB 5009.5—2010）凱氏法測定124份燕麥籽粒樣品的粗蛋白含量，結果表明粗蛋白含量為15.49%～23.77%，平均值為18.93%。這表明試驗選取燕麥品種的粗蛋白含量分布范圍較廣，具有較好的代表性，可用于近紅外光譜定標預測。

2.2校正模型的建立與檢驗結果分析

利用WinISI軟件具備的“標準正常化處理和散射處理，參數選擇為0.0.1.1”對原始光譜數據標準正常化處理，去除樣品間因散射而引起的光譜誤差，消除由光散射產生的線性基線和背景的影響，然后選擇參數求一階導數和二階導數，每隔 4點求導，每隔 4點進行平滑處理，對光譜進行優化，剔除異常光譜。一階導數如圖1所示。運用偏最小二乘法（PLS），建立燕麥蛋白質的定標模型。

2.3燕麥中蛋白質含量的近紅外分析校正模型通過主要參數 RSQ、1-VR、SEC、SECV來衡量近紅外模型。

124份樣品中燕麥粗蛋白含量的RSQ和1-VR分別為0.950 3和0.957 7，SEC和SECV分別為0.285 7和0.382 1。粗蛋白含量模型的決定系數較高，而標準誤差較小，近紅外回歸方程具有較高的準確性，因此利用近紅外光譜分析技術檢測燕麥籽粒中粗蛋白含量是可行且可靠的，可以替代化學測定方法進行粗蛋

白含量測定。

2.4定標模型在育種中的應用

燕麥樣品來自全國10個

省份的14個試點。根據行政區劃，將各試點劃分為3個生態區，分別為華北生態區（內蒙古、山西、河北）、西北生態區（新疆、青海、甘肅、寧夏）和西南生態區（西藏、云南、四川）。由表3可知，山西陽高縣、山西右玉縣、山西大同市3個試點的經緯度、海拔以及降水量等不同，同一品種粗蛋白含量存在差異，山西右玉縣17個燕麥樣品的粗蛋白含量低于山西陽高縣和山西大同市。14個試點的219份燕麥籽粒17個燕麥樣品的平均粗蛋白含量均存在明顯差異（表3），其中甘肅試點粗蛋白含量最高，其次是寧夏試點，四川試點粗蛋白含量最低。由表4可知，3個生態區燕麥的粗蛋白含量由高到低依次為西北（15.33%）、華北（15.16%）、西南（11.32%）。

3討論與結論

由于NIRS具有強大的分析能力，NIRS克服了形態學、細胞學等鑒定方法的弊端，實現了品種的快速準確鑒定，有效保證了被測樣品的完整性，做到無損檢測[20]。 目前，利用NIRS技術鑒定的植物品種已涵蓋多種植物，包括糧食作物、經濟作物和藥用植物等。由于近紅外光譜信息是重疊、復雜的信息，受到測定環境、測量技術、背景成分、樣品待測成分的影響[21]，

使得光譜模型參數構成復雜，其準確性成為自身最大的缺陷。取樣的科學性，減少試驗誤差，提高光譜分析模型的準確性是工作重點。近紅外分析模型的建立需要擁

有典型的種質資源，樣品按不同時間、地點、批次均勻選取，使得樣品具有代表性。該研究中為了使模型達到理想的分析效果，參與定標的124份樣本粗蛋白含量為15.49%～23.77%，盡量減少試驗誤差，注意選擇種質產地

來源的代表性，以提高模型的穩健性，拓寬模型的適用范圍，采用平均化學值、平均光譜為基礎參數的方法，在進行建模軟件的優化、對異常值剔除等選用了合適的預處理方法以盡量扣除干擾信息。該研究中使用定標樣品124份，對我國的復雜多樣、品種繁多的燕麥種質及地域、氣候條件不同的品種而言，不具有普遍代表性，因此定標模型的升級優化工作還在進行。

近紅外光譜分析技術最早應用在農產品方面[22]，在作物育種中常常利用單個籽粒的差異來進行相關性狀的選擇。改變了在燕麥品質育種中，利用傳統化學方法分析測定籽粒品質，破壞籽粒性狀，測定值是剩余樣品的參考值，加快了育種的效率和進程。目前，農作物品質研究涉及籽粒不同成分之間的關系，在品質改良中要針對不同的育種目標和加工用途分別進行選擇。我國燕麥生產主要推廣育成品種，因此籽粒品質性狀的優勢也是主要研究內容。歐陽韶暉等[23]對2013年現代產業技術體系13個區試點燕麥的主要營養品質進行了研究，分析不同生態區燕麥籽粒品質性狀的優勢，探討不同生態區的優勢品種。鄭建梅等[24]通過對內蒙古和河北種植的10個裸燕麥品種進行淀粉品質分析，比較品種的變異性和地區之間的差異性。趙世鋒等[25] 、張智勇等[26]進行了燕麥品種產量和品質性狀的差異分析，通過品質與產量的綜合表現篩選優質、高產、抗逆性強的品種。筆者使用近紅外分析儀對不同生態區不同試點的燕麥品種材料進行測定，花費時間短，操作簡單，結果可靠，同時利用近紅外光譜

分析儀可以實現對整粒進行非破壞性測定，對于達到要求的樣品還可以應用于育種實踐中。通過對國內14個燕麥主產區燕麥品種展示的樣品進行粗蛋白含量分析，在不同種植地區以及華北、西北、西南等不同生態區之間，燕麥粗蛋白含量差異明顯。燕麥營養品質在不同品種、不同地區及不同年份之間存在差異[23]，營養成分的含量會受產地地理坐標（經度、緯度、海拔和降水量）的影響，但不同燕麥受影響的方式可能不同，緯度對蛋白質含量的影響顯著[18]。選育優良的燕麥品種和適宜的推廣種植產地，需要進行連續多年的栽培種植和觀察，并結合各種植區的氣候、生態、海拔、經緯度、水土等條件，深入探究營養品質、燕麥產量變化和生態環境之間的關系。

該研究采用種質資源庫中的124份資源建立燕麥近紅外模型，并對2011年現代產業技術體系新品種展示試驗的14個地區17個品種的蛋白質進行分析。結果表明，利用近紅外光譜技術對燕麥種質資源的主要品質性狀進行鑒定評價可以獲得理想的結果，在今后的燕麥蛋白質育種工作中加強高蛋白種質的篩選和利用，通過蛋白質含量高的燕麥資源與生產上具有廣泛利用價值、農藝性狀優良的燕麥品種雜

交，在育種分離的低世代，利用近紅外分析技術輔助，定向增加選擇壓可能是燕麥高蛋白質育種的一條有效途徑，該技術與常規的化學分析方法相比是有效、簡便、環保、實用的快速鑒定方法；對燕麥種質資源主要品質性狀及其不同產地的影響進行分析，為燕麥優良品質資源的選擇、收集提供了新途徑。

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