用CIA模型探討壯醫滾克陽證與陰證動物模型的建立

梁江洪　李鳳珍　龍朝陽　鐘麗雁　柏春暉　梁艷　蔣桂江　王苑儷

[摘要]目的：以膠原誘導性關節炎（CIA）模型為基礎，附加模擬的風、寒、濕、熱環境，建立符合壯醫病因理論的動物模型。方法：將40只雌性Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽證組與陰證組每組各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐劑和牛II型膠原蛋白誘導大鼠CAI模型，陽證組在每天附加風、濕、熱刺激持續lh，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度（37±1）℃；陰證組每天附加風、寒、濕刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度（8±1）℃。比較各組大鼠關節炎-體長溫度差值、計算關節炎癥積分以及ELISA只測定TNF-a、IL-1B水平的差異結果：陰證組關節-體表溫度差值、炎癥指數方面均低于陽證組，差異有統計學意義（P<0.05）；陰證組大鼠血清TNF-d、IL-1B水平均低于陽證組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：通過風、寒、濕刺激的CIA大鼠可做為陰證模型的參考，通過風、濕、熱刺激的CIA大鼠可做為陽證模型的參考。同時也存在造模復雜化、大鼠死亡率增的缺點，有待進一步完善。

[關鍵詞]動物模型；滾克；類風濕關節炎；陽證與陰證；壯醫

類風濕關節炎是臨床常見的自身免疫性疾病，其發病機制非常復雜，主要的病理表現為滑膜增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成并造成軟骨和骨質破壞。目前常用CIA模型來研究類風濕關節炎的發病機制，但該模型的發生機制目前尚無定論，可以肯定：免疫系統對CⅡ的高度敏感性是該模型建立的主要原因，細胞和體液免疫均參與了病理過程。類風濕關節炎在壯醫的病名為滾克，緣由風、寒、濕、熱毒侵襲人體，阻滯三道兩路而致病，臨床辨證分為陽證、陰證。本研究嘗試以CIA模型為基礎，附加模擬的風、寒、濕、熱環境，建立符合壯醫病因理論的動物模型，為后續相關動物實驗提供參考。

1.材料和造模

1.1實驗材料 SPF級雌性Wistar大鼠（生產許可證：SCXK2014-0002），體重（110±20）g，購自廣西中醫藥大學實驗動物中心。牛Ⅱ型膠原蛋白（批號：150230）、弗氏不完全佐劑（批號：150207）、IL-1B（批號：1006-63）、TNF-a試劑盒（批號：1100-86）購于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作 參考文獻自制造模箱，以自行改裝的空調系統控制箱內溫度，以超聲霧化器霧化滅菌水控制箱內濕度，以鼓風機提供風源。

1.3CIA大鼠造模方法 在無菌條件下，用0.1moL/L冰醋酸充分溶解牛II型膠原蛋白，制成濃度為4mg/L溶液，再按1：1體積與弗氏不完全佐劑混合、震蕩并充分乳化，制成CⅡ乳劑，保存于4℃冰箱備用。試驗時每只大鼠CII乳劑0.25mL于頸、背、尾部分多點皮內注射致炎（初次免疫），于7d后按上述方法再次免疫。

2.實驗分組及方法

40只大鼠，適應性飼養7d后，隨機選30只按上述方法造模，造模成功后再隨機分為模型組、陽證組、陰證組，每組10只；余下10只未造模大鼠為空白組。均于室溫（恒溫（20±2）℃，相對濕度50%～60%）下正常喂養。陽證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時每天給予風、濕、熱刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度（37±1）℃；陰證組在首次接受膠原蛋白注射開始同時每天給予風、寒、濕刺激持續1h，條件控制：風速5m/s，相對濕度90%，溫度（8±1）℃。

3.觀察和指標

3.1關節-體表溫度差值 各組大鼠以最腫脹關節體表溫度與腹部體表溫度差值進行比較。體表溫度測量方法，于室溫下，相同時間點用非接觸式紅外測溫儀在相同的距離內測量。

3.2關節炎癥積分 采用關節炎指數積分法評定，評定依據為關節紅腫程度和范圍以及關節腫大和變形情況。0分：無關節炎；1分：有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節部位中度腫脹；3分：關節嚴重腫脹；4分：關節嚴重腫脹且不能負重。每個肢體最高積分為4分，每只鼠最高積分為16分。

3.3血清TNF-a、IL-1B含量 于第1次膠原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動脈采血，分離血清待測，未測的血清放入-4℃低溫冰箱保存。IL-1B、TNF-a均采用ELISA法，按照試劑盒說明書進行。

4.統計學處理

數據分析采用SPSS19.0軟件處理，計量資料采用均數加減標準差（x±s）表示，組問比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

5.結果

5.1關節表面-體表溫差 關節表面-體表溫差（簡稱差值）比較，空白組大鼠膝關節表面溫度均低于體表溫度，與模型組比較，差值明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。陰證組差值小于模型組，差異有統計學意義（P<0.01），表明陰證組關節表面溫差低于模型組；陽證組差值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05），表明陽證組關節表面溫差與模型組相當；陰證組差值與陽證組比較，差異有統計學意義（P<0.05），表明陰證組關節表面溫差低于陽證組。見表1。

5.2關節炎癥指數 空白組炎癥指數為0，與模型組比較，炎癥指數增高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，陽證組關節炎癥指數差異無統計學意義（P>0.05），陰證組關節炎癥指數小于模型組，差異具有統計學意義（P<0.05），表明陰證組關節炎癥程度低于模型組。與陽證組比較，陰證組關節炎癥指數小于陽證組，差異有統計學意義（P<0.05），表明陰證組關節炎癥指數小于陽證組。見表1。

5.3炎癥因子 與空白組比較，模型組TNF-a、IL-1B值均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，陽證組TNF-a、IL-1B統計學差異（P>0.05），陰證組TNF-a、IL-1B值小于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），表明陰證組TNF-a、IL-1B水平低于模型組。與陽證組比較，陰證組TNF-a、IL-1B值小于陽證組，差異有統計學意義（P<0.01），表明陰證組TNF-a、IL-1B水平明顯低于陽證組。見表2。

6.結論

本研究結果表明，陰證組關節一體表溫度差值、炎癥指數方面均低于陽證組（P<0.05），陰證組大鼠血清TNF-a、IL-1B水平均低于陽證組（P<0.05）。表明在比較成熟的CIA模型基礎上，附加風、寒、濕、熱等外界刺激，會對模型大鼠產生影響：通過風、寒、濕刺激的模型大鼠可做為陰證模型的參考；通過風、濕、熱刺激的模型大鼠可做為陽證模型的參考。同時，結果表明，陽證組與模型組在表溫度差值、炎癥指數、血清TNF-0L和IL-1B水平方面無統計學意義（P>0.05），可說明CIA急性期多表現為陽證。本研究探索在CIA模型基礎上建立壯醫滾克病因學說中的陰、陽兩證模型取得初步成效，同時也存在造模復雜化、大鼠死亡率增高的缺點，有待進一步完善。