苦參堿對結腸癌耐藥細胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響

蘇建偉　蔣旗　黃桂柳　鄧志華　胡高裕　周喜漢　王統華

[摘要]目的 探討苦參堿對結腸癌耐藥細胞化療藥物敏感性及自噬水平的影響。方法 分別采用濃度為0.5mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿作用于結腸癌細胞HCT-8/VCR，分別在24 h、48 h，采用CCK-8法檢測苦參堿對結腸癌細胞HCT-8及其耐藥細胞HCT-8/VCR的抑制作用，并計算出抑制率：運用Western Blotting檢測自噬相關基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達。采用流式細胞術檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率。結果在苦參堿作用24 h和48 h后，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強，苦參堿對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，差異有統計學意義（P<0.001）。對各組細胞的凋亡率檢測發現，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統計學意義（P<0.001）。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質中出現了自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。結論苦參堿能夠提高結腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。

[關鍵詞]苦參堿；結腸癌；耐藥細胞化療藥物敏感型；自噬水平

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率一直居高不下。結腸癌患者死亡率高的主要原因是化療過程中細胞對藥物的耐藥性。結腸癌細胞的細胞膜、細胞質、細胞核等作用及結構發生變化，導致化療藥物的敏感性降低，從而產生耐藥性。常見的耐藥途徑如抗凋亡、藥物靶點或代謝酶改變、自噬及結腸癌細胞過度增殖等都是化療藥物產生抗藥性的主要機制。許多學者對多藥耐藥性的抑制劑進行了長久的探索，近年來中醫藥抗腫瘤作用的研究備受關注，尤其在逆轉化療耐藥方面。苦參堿是由豆科植物類提取的生物堿，具有抗腫瘤、抗肝纖維化、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，但在結腸癌自噬方面研究相對較少。本研究觀察苦參堿對結腸癌耐藥細胞的化療藥物敏感性及自噬水平的影響，旨在為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據。

1.資料與方法

1.1實驗儀器 超凈工作臺、CO2恒溫培養箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽消毒器、冰箱、液氮容器、濾器、真空泵、顯微鏡、天平、高速低溫離心機、恒溫水浴鍋、勻漿器、電泳儀、電泳槽、微波爐、平底燒瓶、凝膠成像儀等儀器。

1.2實驗方法

1.2.1CCK-8法檢測 取對數生長期的HCT-8/VCR、HCT-8細胞，按細胞傳代方法制備細胞懸液，并進行細胞計數，將2組細胞接種于96孔板，實驗組加入化療藥長春新堿及5-FU、阿霉素（ADM），空白對照及陰性組加等體積培養液。培養一段時問后觀察細胞株的耐藥情況。

1.2.2CCK-8法檢測苦參堿干預后HCT-8/VCR細胞藥敏性的變化 根據耐藥細胞株HCT-8/VCR的多藥耐藥性的實驗結果.制備HCT-8/VCR+Ma細胞。各取1瓶處于對數生長期的HCT-8/VCR及HCT-8/VCR+Ma細胞，每組分為實驗組、陰性對照組及空白對照組。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制濃度效應曲線.求回歸方程.得出50%抑制濃度（IC50）。計算逆轉倍數：逆轉倍數=耐藥細胞IC50/Ma作用后耐藥細胞IC50。

1.2.3流式細胞術檢測苦參堿作用耐藥細胞后的細胞凋亡率 取對數生長期的HCT-8/VCR及HCT-8細胞，將2組細胞接種于6孔板，每組細胞分別設2個組：對照組、實驗組，實驗組中加入上述適宜濃度的Ma，對照組不經任何處理。繼續培養48 h后，實驗組加人不同濃度的化療藥長春新堿.對照組中的耐藥組加入同濃度、等量長春新堿，對照組的親本細胞組不做任何處理作為陰性對照。繼續培養4 h，取出細胞用FCM法檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western Blotting檢測自噬相關基因P62、Beclin-1、LC3蛋白表達 取處于生長期的HCT-8/VCR，分到2個培養瓶培養48 h，1瓶為實驗組，加人無毒性濃度的Ma.1瓶為陰性對照組.加人等量培養基，繼續培養48 h。用RIPI細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白質樣品，用BCA法測定蛋白質濃度。之后對兩組細胞進行轉膜、SDS-PAGE電泳、封閉與雜交，最后曝光鑒定自噬相關基因的表達。

1.2.5MDC法檢測單用長春新堿或苦參堿或者兩者聯合應用后自噬囊泡的形成 按照實驗分組進行細胞培養，干預48 h后，用PBS洗2次，加適量0.05mmo]/L的MDC染液于37℃溫育1 h.4%多聚甲醛固定15 min.棄甲醛晾干后.熒光顯微鏡下觀察細胞自噬囊泡的形成情況，計數，拍照。

1.3評價指標 （1）在全自動酶標儀上于490 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值，計算5個復孔平均OD值.計算Ma作用48 h后對HCT-8/VCR、HCT-8細胞的抑制率（inhibition rate，IR）。計算公式：IR（%）=[1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。不同濃度的抑制率分別為5個復孔細胞抑制率的平均值；（2）對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為6個孔細胞凋亡率的平均值。

1.4統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，數據以均數±標準差表示，兩組方差齊性采用t檢驗，兩組方差不齊采用t檢驗。多組均數間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用q檢驗（Newman-Keuls法），檢驗水準：a=0.05，雙側檢驗。

2.結果

2.1苦參堿的不同濃度對HCT-8/VCR細胞增殖的抑制率 在苦參堿作用24 h和48 h后，苦參堿對HCT-8細胞增殖有抑制作用且其抑制作用會隨著苦參堿濃度的增加而增強。與濃度為0.5 mg/ml相比較，差異均有統計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2FCM檢測苦參堿作用后兩組細胞HCT-8/VCR的凋亡率比較 運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發現.采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，差異有統計學意義（P<0.001），說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡。見表2。

2.3Western Blotting檢測結果 在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質中出現了帶有細胞器的泡狀結構，經確認為自噬泡。Western Blotting檢測顯示隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強。

3.討論

近年來有關中醫藥治療肝癌的研究取得較大進展，成為臨床實驗研究熱點之一，中藥因其低毒、高效與多階段性作用的優勢，已在腫瘤化療耐藥逆轉方法的研究中逐步受到重視。苦參堿（Matrine）是一種從我國傳統中藥苦參、廣豆根中提取的生物堿。前期研究表明苦參堿對結腸癌患者的恢復有促進作用.它可以使hTERT表達下調.抑制結腸癌細胞增殖和端粒酶活性，誘導細胞凋亡。本研究運用苦參堿對結腸癌細胞HCT-8/VCR進行研究，結果發現，苦參堿具有抗腫瘤的藥理活性，能抑制腫瘤細胞轉移、增殖、誘導其凋亡及向正常細胞分化。苦參堿作用24 h和48 h，HCT-8細胞增殖的抑制作用隨著苦參堿濃度的增加而增強.對HCT-8細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。運用FCM方法對各組細胞的凋亡率進行檢測發現，采用苦參堿的實驗組的細胞凋亡率大大高于對照組，說明苦參堿可以誘導細胞的凋亡，抑制結腸癌細胞增殖。在苦參堿應用24 h后，HCT-8/VCR細胞質中出現了帶有細胞器的泡狀結構，經確認為自噬泡。苦參堿是一類獨特的生物堿，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、治療病毒性肝炎、心肌炎等作用，近年來其抗腫瘤作用的研究備受關注，尤其在逆轉化療耐藥方面。自噬在結直腸癌的發生發展過程中起到了重要作用。自噬可以使結腸癌細胞的適應凋亡刺激、耐受侵襲性以及營養缺乏的能力提高，在某種程度下會引起結腸癌的發生。有研究證實：在早期和進展期結腸癌中關鍵蛋白LC3和Beclin-1表達升高，使結直腸癌核心部位細胞可以耐受營養缺乏和缺氧。誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的主要途徑，是促進患者化療成功的重要因素。在大多數情況下，自噬與結腸癌細胞耐藥性密切相關，抑制自噬就可以增加結腸癌細胞對化療藥物的敏感性，提高患者的化療效果。以往實驗結果表明在LC3細胞形態學、染色等方面苦參堿能夠誘導結腸癌細胞發生自噬。我們用Western Blotting檢測發現隨著苦參堿濃度的增加，P62、Beclin-1、LC3蛋白的表達水平也隨之增強，與上述文獻結果相一致。本研究對苦參堿在結腸癌自噬方面也進行了分析，為臨床應用苦參堿干預腫瘤機理提供依據，但此次研究仍存在樣本例數較少等諸多不足，有必要擴大樣本例數進一步觀察。

綜上所述，苦參堿能夠提高結腸癌耐藥細胞的自噬水平，逆轉結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR的多藥耐藥性，誘導細胞的凋亡，抑制細胞的增殖，為臨床應用苦參堿抗腫瘤提供理論依據。