重組人Hespintor對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

孫 杰，趙梓晗，潘志鵬，潘凌鴻，倫永志,△

(1.莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，福建莆田 351100；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，遼寧大連 116622)

重組人Hespintor對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

孫 杰1，趙梓晗2，潘志鵬2，潘凌鴻1，倫永志1,2△

(1.莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，福建莆田 351100；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，遼寧大連 116622)

[摘要] 目的 完善重組Hespintor蛋白(rHespintor)的純化方法，提高蛋白提取效率，并探討其對肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞增殖及侵襲作用的影響。方法 在重組蛋白提取中增加包涵體洗滌過程，更改蛋白純化緩沖體系，并利用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA)為作用底物，測定純化的rHespintor對胰蛋白酶水解抑制活性。以空白組為對照組，通過MTT實驗、細(xì)胞劃痕愈合實驗、腫瘤細(xì)胞侵襲實驗分別檢測rHespintor對肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞生長的影響及作用效果。結(jié)果 對包涵體蛋白進(jìn)行尿素梯度洗滌后可有效去除目的蛋白中絕大多數(shù)雜蛋白，一步純化后，目的蛋白rHespintor具有較高胰蛋白酶水解抑制活性，且抑制效果呈劑量依賴關(guān)系。rHespintor作用于肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，遷移能力減弱，侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。結(jié)論 rHespintor在體外可明顯抑制肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞的增殖及侵襲作用。

重組蛋白質(zhì)類；絲氨酸蛋白酶抑制因子；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動；細(xì)胞侵襲

在腫瘤的生長、血管生成及侵潤和轉(zhuǎn)移過程中，除了生長因子與抑癌基因突變、細(xì)胞周期改變等上游機(jī)制的參與外，蛋白酶也扮演著最終共同途徑的角色，并且在功能性或病理性組織重建過程中起到重要作用[1]。大量實驗證明，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)弱與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜的能力密切相關(guān)，抑制此類蛋白酶活性，就可能影響腫瘤的進(jìn)程，成為治療腫瘤的一種有效方法。蛋白酶的活性可由多個層次進(jìn)行調(diào)控，但最直接的方法還是阻斷蛋白酶活性。高表達(dá)的蛋白酶抑制劑或者人工合成的蛋白酶抑制劑都能有效地阻斷蛋白酶的激活，阻止ECM的降解[1-3]。現(xiàn)有研究證明，Kazal家族成員大多具有蛋白酶抑制活性，如胰腺分泌的胰蛋白抑制因子、頂體蛋白酶抑制因子、彈性蛋白酶抑制因子等[4-5]。越來越多的研究顯示這一家族的某些成員參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Hespintor作為一個新的Kazal家族成員，其開放讀碼框架(ORF)長度為285 bp，編碼產(chǎn)物是由94個氨基酸殘基組成的絲氨酸蛋白酶抑制因子。分析表明Hespintor分為3部分：N端1～23個氨基酸殘基為信號肽；第35～94個氨基酸含一個典型的Kazal結(jié)構(gòu)域；N端信號肽與Kazal結(jié)構(gòu)域間的24～34位氨基酸殘基構(gòu)成了連接區(qū)。同源分析表明，Hespintor與Kazal家族其他成員在結(jié)構(gòu)上既有相似又有獨(dú)特的特點(diǎn)。因此，開展Hespintor抗腫瘤活性研究將有助于進(jìn)一步了解其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用，為以后研制開發(fā)基于絲氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor的腫瘤治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)質(zhì)粒及菌株：重組大腸埃希菌Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor為本實驗室保存。肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞引自北京市理化分析測試中心。(2) 主要試劑：PageRuler Prestained Protein Ladder購自美國Thermo公司；鼠抗人His·Tag單克隆抗體(一抗)購自科百奧公司；羊抗鼠HRP-IgG(二抗)購自中杉金橋公司；牛血清清蛋白(BSA)、胰蛋白酶(活性大于或等于250 NF U/mg)購自美國Amresco公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(Nα-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide Hydrochloride，BAPNA)購自美國Sigma公司；Ni2+柱(Ni2+-Histrap FF crude 5 mL)購自美國GE Healthcare公司；BCA蛋白水平測定試劑盒購自北京賽馳生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組Hespintor蛋白(rHespintor)包涵體的提取 挑取陽性克隆的Rosetta(DE3)/pET-40b(+)/Hespintor單菌落接種于加有卡那霉素、氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌8 h；按比例擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600為0.6～0.8時，加入終濃度為0.25 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)于30 ℃，180 r/min誘導(dǎo)5 h。收集誘導(dǎo)后Rosetta (DE3)菌液，收集菌體，經(jīng)破碎，洗滌，最后以8 mol/L尿素溶解緩沖液(Binding Buffer)重懸rHespintor包涵體沉淀，將所得上清液抽濾通過0.45 μm膜，備用。

1.2.2 rHespintor包涵體的純化和復(fù)性 按GE公司6×His組氨酸標(biāo)簽蛋白親和層析純化操作對包涵體溶液進(jìn)行純化。用Binding Buffer平衡Ni2+柱，平衡后低速上樣10 mL稀釋后柱前蛋白液，整個過程4 ℃操作。上樣后繼續(xù)用Binding Buffer洗平基線，隨后用Refolding Buffer 20倍柱體積對柱上蛋白進(jìn)行復(fù)性，最后用Elution Buffer洗脫，收集280 nm吸收峰處的目的蛋白。將收集的目的蛋白進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙燃面凝膠電泳(SDS-PAGE)分析后加入透析袋中，以PBS為緩沖液，透析完成后重新收集，并測定蛋白水平，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rHespintor的活性鑒定 所得純化后rHespintor以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。按參考文獻(xiàn)并優(yōu)化rHespintor的酶活性測定方法[6-7]。用含0.4%CaCl2的0.1 mol/L Tris緩沖液(pH8.0)調(diào)節(jié)rHespintor濃度至0.2 mg/mL，取一定量與0.1 mg/mL的100 μL胰蛋白酶(Trypsin，Sigma)反應(yīng)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中rHespintor質(zhì)量與胰蛋白酶質(zhì)量比依次為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、 3∶1、4∶1、5∶1， 37 ℃水浴10 min。隨后加入反應(yīng)底物Na苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA) 300 μL(1 mg/mL)于37 ℃作用10 min，最后加入30%冰醋酸充分混勻，終止反應(yīng)。檢測前室溫8 000 g離心3 min，去除未溶解的BAPNA對檢測的影響。以分光光度計檢測A410 nm數(shù)值。以不加入rHespintor為陰性對照組。按該方法，分析rHespintor對胰蛋白酶水解作用抑制效果的劑量效應(yīng)。根據(jù)下列公式計算rHespintor的抑制率，繪制抑制曲線。

(1)

1.2.4 細(xì)胞增殖抑制實驗 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，每孔200 μL接種至96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。次日分別給予不同濃度的rHespintor處理，使其終濃度分別為1、2、4、8、12、16 μg/mL。另設(shè)無藥物陰性對照組，空白組及順鉑(DDP)陽性對照組。每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)48 、72 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕柔震蕩10 min，于酶標(biāo)儀檢測A570 nm，根據(jù)以下公式計算腫瘤細(xì)胞存活率：

(2)

1.2.5 細(xì)胞劃痕愈合實驗 當(dāng)HepG2細(xì)胞于6孔板內(nèi)培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)時，用10 μL移液槍頭沿底部劃線，PBS清洗3次，加入DMEM(10% FBS)，rHespintor終濃度分別為0、5、10 μg/mL(對照組、低濃度組、高濃度組)。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)0 、12 、24 h分別拍照記錄。

1.2.6 腫瘤細(xì)胞侵襲實驗 將基底膜基質(zhì)膠matrigel用預(yù)冷無血清DMEM稀釋，Transwell 24孔板(8.0 μm，美國Corning公司)上室鋪基質(zhì)膠，37 ℃過夜成膠。終濃度分別為0、5、10 μg/mL(對照組、低濃度組、高濃度組)的rHespintor作用HepG2細(xì)胞4 d后[8-9]，棄培養(yǎng)液，無血清饑餓培養(yǎng)12 h后經(jīng)0.25%胰酶消化調(diào)整細(xì)胞密度至4×105/mL。上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含重組肝細(xì)胞生長因子(rHGF)作為趨化因子的DMEM(含0.1%FBS，40 ng/mL rHGF)[10]。37 ℃、5%CO2孵育24 h。取出小室，預(yù)冷甲醛固定20 min，PBS洗滌2次；結(jié)晶紫避光染色30 min，PBS洗滌兩次；用棉簽輕輕擦拭聚碳酯膜上室面的細(xì)胞。小心切下膜片，置載玻片上滴加中性速干膠后以蓋玻片封片。顯微鏡下觀察，每張膜取5個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 rHespintor的誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體的提取 誘導(dǎo)后的Rosetta (DE3)菌液離心后，菌體經(jīng)溶菌酶裂解后離心得菌體沉淀，將菌體沉淀重懸后進(jìn)行SDS-PAGE分析，可見rHespintor以包涵體的形式存在于沉淀當(dāng)中。先后經(jīng)過2 mol/L尿素和4 mol/L尿素洗滌包涵體沉淀去除雜蛋白，最后以8 mol/L尿素(Binding Buffer)溶解沉淀，得到包涵體溶解液。誘導(dǎo)后將全菌沉淀和上清液分別作SDS-PAGE分析，重組蛋白以包涵體形式全部集中在沉淀中；經(jīng)先后2次洗滌液能有效去除雜蛋白，提高粗提蛋白純度，見圖1。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)后全菌沉淀；2：誘導(dǎo)后全菌上清液；3：裂解后全菌沉淀；4：一次洗滌后上清液；5：二次洗滌后上清液；6：rHespintor包涵體溶液。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化rHespintor。

2.2 rHespintor的純化 將包涵體溶解液經(jīng)Ni2+親和層析柱純化，同時在鎳柱上完成對rHespintor的復(fù)性過程，洗脫后所得蛋白經(jīng)半透膜脫鹽后作SDS-PAGE分析，得到單一條帶(圖2)。經(jīng)Western blot鑒定， rHespintor成功表達(dá)His-Tag，見圖3。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化rHespintor。

2.3 純化rHespintor的活性檢測 胰蛋白酶可水解低分子底物BAPNA，使之釋放出黃色的對硝基苯胺，該物質(zhì)在405 nm處有最大吸收值。若在此反應(yīng)體系中加入胰蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的水解活性，可使A405 nm吸收值下降。結(jié)果顯示：10 μg rHespintor與10 μg胰蛋白酶作用，rHespintor可抑制30.99%的胰蛋白酶活性。當(dāng)rHespintor與胰蛋白酶的質(zhì)量比為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1時，胰蛋白酶活性抑制率分別為2.28%、12.37%、30.99%、45.72%、52.29%、59.18%、70.32%。

2.4 rHespintor對HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 rHespintor對肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞有顯著的生長抑制作用。當(dāng)rHespintor作用HepG2細(xì)胞時間相同時，隨著蛋白濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)rHespintor作用HepG2細(xì)胞濃度相同時，隨著作用時間的延長，抑制作用同樣逐漸增強(qiáng)，見圖4。

圖4 rHespintor對HepG2細(xì)胞增殖活性的抑制作用

2.5 rHespintor對HepG2細(xì)胞劃痕愈合及侵襲的影響 實驗組HepG2細(xì)胞與對照組相比，細(xì)胞遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)rHespintor作用HepG2細(xì)胞時間相同時，隨著蛋白濃度的增大，細(xì)胞遷移能力抑制愈加明顯。以rHGF為趨化因子，rHespintor作用后的HepG2細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)不同濃度的rHespintor同時作用于HepG2細(xì)胞時，隨著蛋白濃度的增大，細(xì)胞侵襲能力下降愈加明顯，見圖5、6。

圖5 rHespintor對HepG2細(xì)胞劃痕愈合能力的抑制作用

A：對照組；B：低濃度組；C：高濃度組；a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與低濃度組比較。

3 討 論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜過程，包括腫瘤細(xì)胞的黏附和脫黏附作用，ECM的降解和重建作用等過程，其中腫瘤細(xì)胞水解ECM是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的首要步驟和分子基礎(chǔ)。尿激酶型纖溶酶原激活系統(tǒng)可以促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的生長，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程中起重要作用。當(dāng)尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)與其受體(uPAR)結(jié)合后，活化生成纖溶酶，纖溶酶即可直接降解ECM，又可通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)通路參與降解ECM[11-15]。諸多實驗結(jié)果表明，抑制尿激酶型纖溶酶原激活系統(tǒng)中uPA/uPAR活性可組織腫瘤細(xì)胞的侵襲和(或)遷移運(yùn)動[16-17]。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的主要原因。尋找安全有效、不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物一直是各國學(xué)者孜孜以求的目標(biāo)。多種絲氨酸蛋白酶抑制因子已被證實具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，引起腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，因此相關(guān)研究也吸引了更多關(guān)注。

本研究通過前期研究構(gòu)建的Hespintor-Kazal原核表達(dá)體系[18]，采用IPTG誘導(dǎo)獲得了Hespintor-Kazal融合標(biāo)簽蛋白的大量表達(dá)。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，多種真核基因已成功在E.coli中獲得了高效表達(dá)。但是大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)無法對真核基因翻譯后蛋白進(jìn)行加工，難以形成正確的二硫鍵配對及空間構(gòu)象，從而所得重組蛋白往往缺乏良好的生物學(xué)活性。而當(dāng)外源基因在E.coli高效表達(dá)式，容易以包涵體(inclusion body)形式聚集在細(xì)胞內(nèi)。要獲得具有與天然蛋白相同活性的重組蛋白，必須首先分離獲得包涵體，并進(jìn)行洗滌，然后用高濃度的變性劑(如6～8 mol/L鹽酸胍，8～10 mol/L尿素)溶解包涵體，再將所溶解的無活性包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性，使其正確折疊，恢復(fù)天然的蛋白分子構(gòu)象。在實驗過程中，變性后的包涵體蛋白進(jìn)行再折疊和復(fù)性，占據(jù)了重組蛋白質(zhì)整個工藝的關(guān)鍵步驟，是生物工程技術(shù)中的一個難點(diǎn)問題。過程的每一步都會造成目的蛋白的丟失，而且步驟越多，目的蛋白丟失越多，產(chǎn)率越低。本研究在蛋白純化步驟中，增加梯度洗滌過程，盡量去除雜質(zhì)蛋白對純化過程的影響；提高緩沖液中咪唑的基礎(chǔ)濃度，降低宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)與親和層析柱的結(jié)合，增強(qiáng)組氨酸標(biāo)簽蛋白的結(jié)合；用Tris緩沖液替代磷酸緩沖液，減低非組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的結(jié)合力。

本研究中，rHespintor可在體外顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用，抑制其對基底膜基質(zhì)膠matrigel的黏附和侵襲作用。因此，rHespintor可通過抑制肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞水解ECM及細(xì)胞基底膜的能力，從而達(dá)到抑制其侵襲浸潤的作用。這一過程可通過其在細(xì)胞外抑制MMPs的激活，從而導(dǎo)致了ECM降解能力的下降。

綜上所述，本研究為rHespintor發(fā)展成新型抗腫瘤藥物提供了體外研究依據(jù)，后期將更深層次探討rHespintor的抗腫瘤分子機(jī)制，并進(jìn)一步完善其在動物體內(nèi)的抗腫瘤研究。

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Inhibitory effects of recombinant human Hespintor on proliferation,migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells

SunJie1,ZhaoZihan2,PanZhipeng2,PanLinghong1,LunYongzhi1,2△

(1.FacultyofLaboratoryMedicalScience,SchoolofPharmacyandMedicalTechnology,PutianUniversity,Putian,Fujian351100,China;2.FacultyofLaboratoryMedicalScience,CollegeofMedicine,DalianUniversity,Dalian,Liaoning116622,China)

[Abstract] Objective To perfect the purification method of recombinant fusion protein of Hespintor (rHespintor) for increasing the protein extraction efficiency,and to investigate its effects on the proliferation,migration and invasion of hepatoblastoma cell line HepG2.Methods In the recombinant protein extraction,the inclusion body washing process was added and the protein purification buffer system was changed.BAPNA was used as the substrate.The inhibitory effect tof purified rHespintor on trypsin hydrolysis was detected.The blank group served as the control group.The MTT test,cell scratch wound healing test and tumor cell invasion test were performed to detect the effect of rHespintor on growth of hepatoblastoma HepG2 cells and its effect.Results The urea gradient washing on the inclusion body protein could effectively remove the vast majority of impure proteins from the targeted protein.After one-step purification,the target protein rHespintor exhibited a high inhibition effect of trypsin hydrolysis,and the inhibitory effect was exhibited a dose-dependent manner.After acting on hepatoblastoma HepG2 cells with rHespintor,the cell proliferation ability was inhibited,the migration ability was reduced and the number of invaded cells were significantly decreased.Conclusion rHespintor can significantly inhibit the proliferation,migration and invasion of hepatoblastoma cell line HepG2 cells in vitro.

recombinant protein;serine proteinase inhibitor;cell proliferation;cell movement;cell invasion

孫杰(1978-)，副主任技師，本科，主要從事臨床微生物學(xué)研究。△

，E-mail：lunyz@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.009

R730.54

A

1671-8348(2017)09-1182-04

2016-08-31

2016-11-17)

論著·基礎(chǔ)研究