阿托伐他汀對糖尿病心肌病大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶的影響

劉 會，張曙影，榮季冬

(1.貴州省人民醫院心內科，貴陽 550002；2.大連大學附屬中山醫院心內科，遼寧大連 116001；3.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州遵義 563000)

阿托伐他汀對糖尿病心肌病大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶的影響

劉 會1，張曙影2△，榮季冬3

(1.貴州省人民醫院心內科，貴陽 550002；2.大連大學附屬中山醫院心內科，遼寧大連 116001；3.遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州遵義 563000)

[摘要] 目的 探討阿托伐他汀對糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌組織賴氨酰氧化酶(LOX)表達的影響及機制。方法 將30只DCM大鼠分為DCM組、治療組(阿托伐他汀2 mg·kg-1·d-1灌胃)、β氨基丙腈(BAPN)組(BAPN 80 mg·kg-1·d-1灌胃)，每組10只；另選10只SD大鼠為空白對照組。第8周末處死大鼠。提取心肌組織RNA及蛋白質，RT-PCR和Western blot測定心肌組織LOX、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及核因子-κB(NF-κB) mRNA和蛋白表達。結果 DCM組LOX、MMP-2及NF-κB mRNA和蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)；與DCM組比較，治療組及BAPN組LOX、MMP-2及NF-κB mRNA和蛋白表達明顯下調(P<0.01)。結論 阿托伐他汀可逆轉DCM大鼠心肌組織LOX表達，進而調控MMP-2及NF-κB表達。

糖尿病心肌?。坏鞍彼?6-氧化酶；基質金屬蛋白酶2；NF-κB；阿托伐他汀

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的病理特征為心肌肥厚及心肌纖維化，可引起嚴重的充血性心力衰竭。心室重塑及心肌纖維化貫穿DCM病程的始終。高糖毒性可引起大量的氧自由基產生，體內氧化-還原平衡被破壞，激活基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等在心肌纖維化及心臟重塑中扮演重要角色的細胞因子[1]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)是一種細胞外銅依賴性的單胺氧化酶[2]，參與心臟重塑，其表達量與心肌纖維化的程度相關[3]。此外，慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX表達也明顯上調，而且阿托伐他汀可通過下調LOX而抑制心臟重塑[4]。目前的研究表明LOX在心臟重塑中扮演重要角色[5]，但LOX是否參與DCM的心室重塑尚未涉及。本實驗擬通過阿托伐他汀對DCM大鼠心肌組織LOX表達的影響，探討阿托伐他汀對DCM心肌組織的保護作用，為臨床應用阿托伐他汀抑制心臟重塑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：50只8周齡健康雄性SD大鼠，由大連醫科大學提供。實驗動物在22～25 ℃清潔級實驗室中進行分籠飼養。試劑及儀器：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司；枸櫞酸緩沖溶液購自上海信裕生物技術有限公司；阿托伐他汀購自美國輝瑞制藥有限公司；β氨基丙腈(BAPN)購自上海廣拓化學有限公司；RT-PCR試劑盒、RNAiso Plus、DL1000 DNAmaker、瓊脂糖購自大連寶生物工程有限公司；Western blot及凝膠電泳試劑、細胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質定量試劑盒購自南京凱基生物有限公司；羊抗人LOX多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP結合的二級抗體、鼠抗MMP-2、鼠抗β-actin購自北京中杉金橋生物有限公司；Millipore 超濾離心管購自上海Millipore公司；ECL化學發光試劑盒購自上海碩嘉生物科技有限公司；超聲心動圖購自加拿大Visual Sonics公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與DCM大鼠模型的建立 選取10只大鼠設為對照組。40只大鼠單次腹腔注射STZ 65 mg/kg制作糖尿病動物模型[6]，STZ溶解于pH 4.5的0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖溶液中。72 h后測尾靜脈血糖大于或等于 16.7 mmol/L視為糖尿病動物模型建立成功。模型成功33只(模型組)，病死7只，死亡率為17.5%。4周后行超聲心動圖檢測，繼之抽取3只，HE染色觀察心肌組織纖維化程度，評估DCM模型。將余下30只DCM大鼠分為DCM組、治療組和BAPN組，每組10只。DCM組予等量生理鹽水灌胃；治療組予阿托伐他汀2 mg·kg-1·d-1灌胃；BAPN組予BAPN 80 mg·kg-1·d-1灌胃。實驗過程中，仔細觀察大鼠的活動狀態、毛色、進食、飲水及體質量等一般情況。

表1 所用引物系列信息

1.2.2 超聲心動圖檢測 腹腔注射STZ 4周末，10%的水合氯醛(4 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，8%Na2S脫去大鼠胸部皮毛。采用VisualSonics Vevo770超聲心動圖儀17.5 MHz探頭測量左心室舒張末期內徑(LVEDd)、左心室收縮未期內徑(LVESd)、左心室射血分數(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.2.3 組織標本處理 大鼠麻醉狀態下開胸，取出心臟，去掉殘余的大血管及心外膜，取出右心室和右心房，保留室間隔，冷肝素鹽水洗凈心腔內殘余的血液。垂直心臟左心室長軸將心臟一分為二，心底部凍存于液氮中檢測LOX、MMP-2及核因子κB(NF-κB) mRNA和蛋白質，心尖部用于HE染色。常規石蠟包埋后制成5 μm的石蠟切片。行HE染色。采用Nikon Eclipse 80i 顯微鏡對所得切片進行觀察并進行圖像采集。

1.2.4 RT-PCR檢測 提取凍存心肌組織總RNA，計算總RNA水平和純度。取1 μg總RNA按逆轉錄試劑盒說明書方法合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，產物按PCR試劑盒說明書方法進行PCR反應。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成，引物信息見表1。反應條件：95 ℃預變性2 min，經過n個循環(95 ℃變性25 s，復性48～63 ℃ 35 s，72 ℃ 延伸65 s)，終末72 ℃延伸 5 min 。PCR產物以3%瓊脂糖凝膠電泳，以Bio-Image Analysis System分析各條帶的光密度值，計算目的條帶與內參(β-actin)的比值，以此作為目的基因的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測 提取大鼠心肌組織全蛋白，測定蛋白水平。取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白及轉膜，15%脫脂牛奶-PBST溶液室溫下封閉60 min，加入一級抗體(β-actin：鼠抗單克隆抗體，1∶2 000；LOX：羊抗人多克隆抗體，1∶500；NF-κB：鼠抗單克隆抗體，1∶500；MMP-2：鼠抗單克隆抗體，1∶500；)，4 ℃搖床上過夜，磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜10 min×5次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體(β-actin：山羊抗小鼠，1∶20 000；LOX：兔抗羊，1∶2 000；NF-κB：山羊抗小鼠，1∶2 000；MMP-2：山羊抗小鼠，1∶2 000)，室溫下搖床上孵育60 min，PBST洗膜10 min×5次，增強化學發光(ECL)法發光顯像，X線壓片曝光，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統進行灰度分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對照組10只大鼠全部存活，大鼠活潑，無白內障現象；DCM組存活6只；BAPN組存活7只；治療組存活7只，活動狀態與DCM組比較無明顯變化。解剖死亡大鼠發現心臟破裂、肝大。

2.2 各組大鼠超聲心動圖比較 與對照組比較，模型組大鼠心功能明顯受損，表現為心腔擴大，左心室收縮功能及舒張功能下降。LVEDd和LVESd明顯增加，LVEF及短軸縮短率(%FS)明顯下降(P<0.05)，見表2。

表2 對照組與模型組大鼠心臟超聲參數比較

a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 HE染色結果比較 對照組大鼠心肌細胞形態正常，排列整齊，細胞質染色均勻(圖1A)。模型組大鼠心肌細胞水腫，排列紊亂，細胞間隙增寬，可見心肌纖維斷裂，見圖1B。

A：對照組；B：模型組。

2.4 各組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB mRNA表達水平比較 與對照組比較，DCM組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB mRNA表達明顯增加(P<0.01)；與DCM組比較，治療組大鼠干預4、8周后心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB mRNA明顯下調(P<0.01)，但干預4 周與8周比較差異無統計學意義(P>0.05)；與DCM組比較，BAPN組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB mRNA表達明顯下降(P<0.01)，見表3、圖2。

表3 各組大鼠心肌組織LOX 、MMP-2和NF-κB mRNA表達的比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與DCM組比較；c：P<0.01，與治療組比較。

M：標記物；1：對照組；2：DCM組；3：治療組 4周；4：治療組 8周；5：BAPN組。

2.5 各組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB 蛋白表達水平的比較 與對照組比較，DCM組大鼠心肌組織LOX、MMP-2及NF-κB 蛋白表達明顯增高(P<0.01)；與DCM組比較，治療組及BAPN組大鼠心肌組織LOX、MMP-2及NF-κB 蛋白表達明顯下降(P<0.01)，見表4、圖3。

表4 各組大鼠心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB蛋白表達水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與DCM組比較；c：P<0.01，與治療組比較。

1：對照組；2：DCM組；3：治療組；4：BAPN組。

3 討 論

DCM是糖尿病患者晚期死亡的主要原因之一，表現為心肌重塑及纖維化，心肌間質中大量膠原纖維沉著，使心臟順應性降低，引起心臟舒張及收縮功能減低[7]。高糖毒性及胰島素抵抗促進心肌組織氧化應激損傷、心肌細胞肥大和凋亡壞死，使心肌纖維化增加出現心臟舒張功能不全[8]。隨著病程進展，出現心臟結構的重塑，心室壁增厚、左心室質量明顯增加，而在病程的晚期出現收縮功能不全[9-10]。本研究結果顯示，腹腔注射STZ后，大鼠心功能明顯下降，表現為心腔擴大，左心室收縮功能及舒張功能下降，LVEDd和LVESd明顯增加，LVEF及%FS明顯下降，心肌細胞排列紊亂。

LOX主要由平滑肌細胞及成纖維細胞生成，是膠原纖維和彈性纖維取得穩定性和發育成熟的關鍵酶，具有穩定細胞外基質免受MMP降解的功能[2]。LOX表達過少，組織力學性能不足；但LOX表達過多，易致膠原沉積及纖維化[11]。心肌組織中過度的膠原沉積可引起心肌纖維化，影響心臟舒張功能，最終導致心力衰竭。特發性擴張型心肌病患者心肌組織LOX及轉化生長因子β(TGF-β)表達明顯增加，TGF-β還可通過上調LOX的表達參與促進Ⅲ型膠原纖維蛋白的合成及激活MMP活性，而且LOX表達上調與心肌纖維化相關[12]。慢性心力衰竭左心室順應性降低與心肌組織LOX表達上調有關，LOX表達增加可參與促進膠原纖維共價交聯，引起心肌僵硬度增加，這可能是引起慢性心力衰竭患者心臟重塑的一個重要原因[13]。此外，LOX參與心肌梗死后心室重塑，且與細胞外基質成分改變及心肌纖維化形成有關[3]。Xiao等[14]復制獼猴心肌梗死模型，提取梗死區心肌組織測定LOX RNA和蛋白，梗死區心肌組織LOX表達較假手術組明顯增加，此外，心肌組織Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維也明顯增加。此外，提取心肌梗死小鼠心肌組織RNA及蛋白質，對LOX的RNA及蛋白質定量后發現，梗死區心肌組織LOX表達明顯高于非梗死區，而且伴隨著大量膠原纖維沉積，這表明LOX與心肌纖維化相關，研究還發現，TGF-β信號通路在LOX促進心肌纖維化過程中發揮一定的作用[15]。既往研究表明，慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX表達上調，阿托伐他汀可下調慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX，LOX可通過p38及NF-κB信號通路調節MMP-9表達[4]。

本實驗表明，對照組大鼠心功能正常，DCM組大鼠心功能惡化，心肌組織LOX、MMP-2和NF-κB mRNA和蛋白表達明顯上調；應用阿托伐他汀干預DCM大鼠后，心肌組織LOX、MMP-2及NF-κB mRNA和蛋白表達下降；應用LOX的特異性抑制劑BAPN后心肌組織LOX、MMP-2及NF-κB mRNA和蛋白表達下降。MMP-2和NF-κB作為重要的細胞因子參與心肌組織的重塑，本實驗提示阿托伐他汀可逆轉DCM大鼠心肌組織LOX表達，LOX可調節DCM大鼠心肌組織MMP-2及NF-κB表達；阿托伐他汀是否可通過別的信號通路調節MMP-2及NF-κB表達，本研究未涉及。

本研究結果證實，DCM大鼠心肌組織LOX表達增加，阿托伐他汀可抑制DCM大鼠心肌組織LOX的表達；LOX可調節DCM大鼠心肌組織NF-κB和 MMP-2表達，這可能是阿托伐他汀抑制心臟重塑的重要機制，可能會為應用阿托伐他汀抑制心臟重塑提供新的理論依據。

[1]黃婭茜，王憲，孔煒．糖尿病心肌病發病機制的研究進展[J]．生理科學進展，2010，41(1)：31-36．

[2]Csiszar K.Lysyl Oxidase:a novel multifunctional amine oxidase family[J].Prog Nuclei Acid Res Mol Bio,2001,70(1):1-32.

[3]Xie Y,Chen J.Immunohistochemical detection of differentially localized up-regulation of lysyl oxidese and down-regulation of matrix metallopreinase-1 in rhesus monkey model of chronic myocardial infarction[J].Exp Biol Med,2012,237(7):853-859.

[4]劉會，榮季冬，袁國軍，等．阿托伐他汀對慢性心力衰竭小鼠心肌組織賴氨酰氧化酶表達的影響[J]．中華老年心腦血管病雜志，2013，15(6)：628-631．[5]Martinez-Martinez E,Rodriguez C,Galan M,et al.The lysyl oxidase inhibitor(β-aminopropionitrile) reduced leptin profibrotic effects and ameliorates cardiovascular remoding in diet-induced obesity in rats[J].J Mol Cell Cardiol,2016,92(3):96-104.

[6]Wei M,Ong L,Smith MT,et al.The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complication of human diabetes[J].Heart Lung Circ,2003,12(1):44-50.

[7]鄭國營．糖尿病心肌病舒張功能不全的研究進展[J]．醫學綜述，2013，19(9)：1647-1649．

[8]Maclver DH,Townsend M.A novel mechanism of heart failure with normal ejection fraction[J].Heart,2008,94(4):446-449.

[9]Ozasa N,Furukawa Y,Morimoto T,et al.Relation among left ventricular mass,insulin resistance,and hemodynamic parameters intype 2diabetes[J].Hypertens Res,2008,31(3):425-432.

[10]Van HL,Hamdani N,Handoko ML,et al.Diastolic stiffness of the failing diabetic heart:impertance of fibrosis,advanced glycation end products,and myocyte resting tension[J].Circulation,2008,117(1):43-51.

[11]Smith-Mungo LI,Kagan HM.Lysyl oxidase:Properties,regulation and multiple functions in biology[J].Matrix Biol,1998,16(7):387-398.

[12]Sivakumar P,Gupta S,Sarkar S,et al.Upergulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy[J].Mol Cell Biochem,2008,307(1):159-167.

[13]Lopez B,Querejeta R,Gonzalez A,et al.Impact of treatment on myocardial lysyl oxidase expression and collagen cross-Linking in patients with heart failure[J].Hypertension,2009,53(2):236-253.

[14]Xiao Y,Nie X,Han P,et al.Decreased copper concentrations but increased lysyl oxidase activity in ischemic hearts of rhesus monkeys[J].Metallomics,2016,8(9):973-980.

[15]Gonzalez-Santamaria J,Villalba M,Busnadiego O,et al.Matrix cross-linking lysyl oxidases are induced in response to myocardial infarction and promote cardiac dysfunction[J].Cardiovasc Res,2016,109(1):67-78.

Effects of atorvastatin on expression of lysyl oxidase in myocardial tissue of rats with diabetic cardiomyopathy

LiuHui1,ZhangShuying2△,RongJidong3

(1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China; 2.DepartmentofCardiology,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian,Liaoning116001,China; 3.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China)

[Abstract] Objective To study the effects of atorvastatin on expression of lysyl oxidase(LOX) in myocardial tissue of rats with diabetic cardiomyopathy (DCM) and its mechanism.Methods Thirty DCM SD rats were randomly divided into 3 groups:DCM group,treatment group (atorvastain 2 mg· kg-1· d-1by gastric gavage) and β-aminopropionitrile group(β-aminopropionitrile 80 mg·kg-1·d-1by gastric gavage ),10 cases in each group.Other 10 SD rats were selected as the control group.At the end of week 8,the rats were killed for extracting the myocardial tissue RNA and protein.Expression levels of LOX,MMP-2 and NF-κB mRNAs and proteins in myocardial tissue of DCM rats were measured by RT-PCR and Western blot.Results The expression levels of LOX,MMP-2 and NF-κB mRNAs and proteins in the DCM group were significantly higher than those in the control group(P<0.01),and compared with the DCM group,the expression of BAPN LOX,MMP-2 and NF-κB mRNA and proteins in the treatment group were significantly deceased (P<0.01).Conclusion Atorvastatin can reverse the expression of LOX in myocardial tissue of DCM rat,and then may regulate the expression of MMP-2 and NF-κB.

diabetic cardiomyopathy;protein-lysine 6-oxidese;matrix metalloproteinase 2;NF-kappa B;atorvastatin

劉會(1985-)，主治醫師，碩士研究生，主要從事心力衰竭方面的診治研究?！?/p>

，E-mail:acezhangsy1868 @163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.006

R542.2

A

1671-8348(2017)09-1172-03

2016-07-18

2016-11-16)

論著·基礎研究