氫氣對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及神經(jīng)細胞凋亡的影響*

夏裕寧，李雪梅，袁楠楠，張鑫磊，譚永星

(桂林醫(yī)學院：1.研究生院；2.附屬醫(yī)院護理部；3.附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西桂林 541001)

·論 著·

氫氣對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及神經(jīng)細胞凋亡的影響*

夏裕寧1，李雪梅2，袁楠楠1，張鑫磊1，譚永星3△

(桂林醫(yī)學院：1.研究生院；2.附屬醫(yī)院護理部；3.附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西桂林 541001)

[摘要] 目的 探討吸入高濃度氫氣(H2)對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷(IRI)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)及腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響。方法 選取72只健康成年SPF級雄性SD大鼠，將其分為對照組(Ⅰ組：不作任何處理)、假手術(shù)組(Ⅱ組)、腦IRI組(Ⅲ組)、氫氣治療組(Ⅳ組)，每組18只。采用線栓法建立大鼠局灶性腦IRI模型。于再灌注24 h后行神經(jīng)功能缺損評分(NDS)，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察大鼠腦缺血梗死程度并計算腦梗死面積，原位末端標記法(TUNEL)技術(shù)檢測各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(AI)，Western blot法和免疫組織化學法檢測大鼠腦皮質(zhì)GRP78、Caspase-12、Bcl-2及Bax蛋白表達。結(jié)果 與Ⅰ、Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組大鼠腦IRI后NDS、腦梗死面積、AI均明顯增加，GRP78、Caspase-12、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯下降(P<0.05)；與Ⅲ組比較，Ⅳ組大鼠NDS、腦梗死面積、AI及Caspase-12、Bax蛋白表達明顯減少，GRP78、Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)。結(jié)論 再灌注同時吸入高濃度H2可通過增加腦IRI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78蛋白表達，并抑制Caspase-12的激活進而抑制ERS并促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能修復(fù)，對大鼠腦IRI起到一定的保護作用。

氫；腦缺血；再灌注損傷；細胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；應(yīng)激

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是臨床常見的具有嚴重危害的病生過程，是包括多種作用機制在內(nèi)的一種復(fù)雜的綜合征[1]。缺血及再灌注所引起的缺氧、能量耗竭、酸中毒、鈣穩(wěn)態(tài)的破壞及大量自由基的生成等均可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，細胞可通過ERS自身產(chǎn)生應(yīng)激性保護作用；但是過強或持久的ERS會激活凋亡信號通路，引起細胞凋亡，加重腦IRI。Ishige等[2]研究表明，ERS在腦IRI過程中處于中心環(huán)節(jié)，可啟動神經(jīng)細胞凋亡途徑。Tian等[3]研究證實，氫氣(H2)可有效降低腦IRI，但H2與腦IRI后ERS的關(guān)系尚不清楚。本研究通過建立大鼠局灶性腦IRI模型，通過觀察IRI后腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡及ERS相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達變化，探討吸入高濃度H2對腦IRI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及神經(jīng)細胞凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠72只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬2012-0002)，體質(zhì)量為(210±10)g。(2)試劑及儀器：原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(羅氏公司，瑞士)；兔單克隆抗GRP78、Bcl-2(Abcam 公司，英國)；兔多克隆抗Caspase-12、Bax(Abcam 公司，英國)；單克隆抗體β-actin(Santa Cruz 公司，美國)；即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒(鼠/兔)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)；辣根酶標記山羊抗兔、小鼠(中山金橋有限生物公司，中國)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；DAB顯色試劑盒(Sigma公司，美國)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(國藥集團化學試劑有限公司，中國)；H2濃度檢測儀檢測(日本新宇宙，型號XP-3140，日本)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將72只大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：對照組(Ⅰ組，不做任何處理)，假手術(shù)組(Ⅱ組，只分離頸動脈即予縫合，同時吸入67%N2+33%O2混合氣體)，腦IRI組(Ⅲ組，腦缺血1 h再灌注24 h，同時吸入67%N2+33%O2混合氣體)，氫氣治療組(Ⅳ組，于腦缺血1 h再灌注同時吸入67% H2+33%O2混合氣體2 h，并每間隔6 h予以吸入H22 h)，每組18只。Ⅱ組與Ⅲ組每次吸氣時間及間隔時間與Ⅳ組相同。

1.2.2 高濃度H2制備及檢測 使用氫氧氣霧化機(上海潓美醫(yī)療科技有限公司，型號AMS-H-01)產(chǎn)氫，電解純水后H2與O2比例為2∶1。將大鼠放入密封的帶有進氣口和出氣口的樹脂玻璃箱子內(nèi)，通過氣體流量計將H2和O2混合后從進氣口輸入箱內(nèi)，殘余氣體從出氣口排出。混合氣中H2濃度使用H2濃度檢測儀監(jiān)測(日本新宇宙，型號XP-3140)。

1.2.3 動物模型制備及處理 參照Zea-Longa的線栓法并加以改良制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。栓線采用直徑0.24～0.26 mm，長4.00 cm 的尼龍線(北京西濃科技有限公司，中國)。用4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定，頸旁正中切口，分離并暴露左側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)外動脈。結(jié)扎左側(cè)頸外動脈根部，暫時結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，由頸外動脈近分叉處剪一小口插人栓線，進線長度18.00～20.00 mm感到有輕微阻力時停止，扎緊并固定插線，阻斷60 min 后，拔出栓線至頸外動脈殘端內(nèi)進行再灌注24 h。Ⅳ組再灌注同時給予吸入67%H2+33%O2混合氣體2 h，以后每間隔6 h給予以吸入H22 h；Ⅱ、Ⅲ組于再灌注同時吸入67%N2+33%O2混合氣體，每次吸氣時間及間隔時間與Ⅳ組相同。Ⅱ組只分離頸動脈但不予結(jié)扎。圍術(shù)期間采取嚴格消毒措施，恒溫毯維持大鼠體溫在37 ℃左右。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損(NDS)評分 各組大鼠于再灌注24 h后及相應(yīng)時間點參考Longa的5級4分法行NDS評分。0分：行走正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1分：垂直提尾時大鼠右前肢不能完全伸展；2分：大鼠行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠行走時向右側(cè)跌倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平明顯下降。1～3分即為制模成功。

1.2.5 TTC染色測定腦梗死面積 于再灌注24 h后，每組各取6只大鼠，用4%水合氯醛麻醉后斷頭取腦。迅速將腦組織置于-20 ℃中速凍20 min后取出，除去額端1.00 mm左右，由前向后每隔2.00 mm作冠狀切片，均勻切成5片。置于2%TTC液中，放入37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，每隔15 min翻面使腦組織均勻染色。染色后可見正常腦組織呈紅色，梗死灶染成白色。將染色后的腦組織用4%多聚甲醛溶液再次固定48 h，數(shù)碼相機拍照并利用ImageJ軟件分析計算梗死面積，計算得梗死面積百分比=(梗死面積/整個腦組織面積)×100%。

1.2.6 TUNEL法檢測腦皮質(zhì)區(qū)凋亡神經(jīng)細胞 于再灌注24 h后，每組取6只大鼠，麻醉后用冰生理鹽水心臟灌注，斷頭取腦，取部分缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)組織于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余部分置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎闷?5 μm冰凍切片行細胞凋亡檢測。應(yīng)用TUNEL 試劑盒檢測各組大鼠腦皮質(zhì)原位神經(jīng)元的凋亡情況，嚴格按照試劑盒操作說明進行檢測。TUNEL染色結(jié)束后，滴加DAPI(1∶1 000)孵育5 min，抗熒光猝滅劑封片，采用Olympus熒光顯微鏡(Olympus公司)觀察并拍照。鏡下觀察紅色熒光為TUNEL 陽性細胞，藍色熒光為DAPI對所有細胞核進行染色。取5個不重復(fù)視野(×200)，計數(shù)細胞總數(shù)和TUNEL 染色陽性細胞數(shù)，計算細胞凋亡指數(shù)(AI)。AI =(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%，采用IPP6.0分析TUNEL陽性細胞和DAPI墨跡，觀察凋亡細胞與神經(jīng)元的位置關(guān)系。

1.2.7 免疫組織化學染色 冰凍切片用PBS漂洗后以PBS∶甲醇∶H2O2(5∶4∶1)溶液阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶活性，1%BSA封閉1 h，按1∶200稀釋一抗 Bcl-2、Bax及Caspase-12，4 ℃孵育過夜；次日滴加即用型快捷免疫組化Max Vision試劑盒(鼠/兔)試劑，室溫孵育20 min，DAB染色3～5 min。操作過程按各試劑盒說明進行。光鏡下觀察并拍照，每張切片取5個高倍視野(×200)，對腦皮質(zhì)區(qū)染色陽性細胞計數(shù)。

1.2.8 Western blot法檢測 Western blot法檢測腦皮質(zhì)區(qū)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、Caspase-12的表達。取備用皮質(zhì)區(qū)腦組織100 mg剪碎、研磨后，加入組織裂解液提取總蛋白， BCA 試劑盒檢測蛋白濃度后，蛋白變性，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜行免疫反應(yīng)后于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，按1∶1 000稀釋Bcl-2、Bax及GRP78、Caspase-12抗體，4 ℃孵育過夜，次日取出用TBST洗膜，孵育二抗1 h，再用TBST洗二抗，加ECL發(fā)光液，放入Bio-Rad凝膠成像儀中自動顯影讀出條帶，測得各目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照算得各組相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠NDS癥狀評分及TTC染色比較 Ⅰ、Ⅱ組的大鼠無行為學異常，行動自如，飲食正常，反應(yīng)敏捷；Ⅲ組大鼠精神萎靡，食欲欠佳，行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒，反應(yīng)遲鈍；Ⅳ組大鼠行動較靈敏，飲食正常，行走速度較快且不轉(zhuǎn)圈，反應(yīng)較快，NDS評分明顯低于Ⅲ組(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ組無梗死灶，Ⅲ、Ⅳ組腦缺血1 h再灌注24 h腦組織TTC染色可見明顯梗死灶，但Ⅳ組梗死面積較Ⅲ組明顯減少(P<0.01)，見表1、圖1。

2.2 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)TUNEL染色檢測細胞凋亡比較 腦皮質(zhì)區(qū)熒光雙標DAPI染色結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ組神經(jīng)元細胞核圓且大，排列緊密，幾乎未見核碎片；Ⅲ組神經(jīng)元胞核濃縮深染，核間隙增寬，可見較多細胞核碎片；與Ⅲ組相比，Ⅳ組細胞核較飽滿，細胞核碎片較少。TUNEL染色顯示，Ⅰ、Ⅱ組偶見凋亡細胞，兩組凋亡細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Ⅰ、Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組腦IRI后凋亡細胞數(shù)明顯增多，AI明顯升高(P<0.01)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組腦IRI后凋亡細胞減少，AI下降(P<0.01)。各組切片Merged結(jié)果顯示，TUNEL染色陽性細胞與DAPI染色細胞核大致重疊，見圖2、表2。

表1 各組大鼠NDS評分及皮質(zhì)區(qū)梗死面積比較

a：P<0.05，與Ⅰ、Ⅱ組比較；b：P<0.05，與Ⅲ組比較。

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元GRP78、Caspase-12、Bcl-2和Bax蛋白表達比較 與Ⅰ、Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組大鼠IRI 24 h后神經(jīng)元GRP78蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Ⅲ組IRI 24 h后神經(jīng)元Caspase-12和Bax蛋白表達水平明顯升高，而Bcl-2表達量明顯降低(P<0.05)；與Ⅲ組比較，Ⅳ組IRI 24 h后神經(jīng)元Caspase-12和Bax蛋白表達水平明顯降低，GRP78蛋白表達量進一步升高，Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ組與Ⅳ組IRI 24 h后神經(jīng)元Caspase-12、Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖3。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

圖2 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)TUNEL原位神經(jīng)細胞凋亡檢測結(jié)果(×200)

表2 各組大鼠AI及腦皮質(zhì)GRP78、Caspase-12等的蛋白表達比較

a：P<0.05，與Ⅰ、Ⅱ組比較；b：P<0.05，與Ⅲ組比較。

圖3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)GRP78、Caspase-12等蛋白表達

2.4 各組大鼠免疫組化染色檢測腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax、Caspase-12的表達比較 Ⅰ、Ⅱ組未見Bax、Caspase-12陽性細胞，而Bcl-2陽性細胞表達較多。與Ⅰ、Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組腦IRI 24 h后Bax、Caspase-12表達明顯增多，Bcl-2表達明顯減少(P<0.01)；與Ⅲ組比較，Ⅳ組腦IRI 24 h后Bcl-2表達明顯增多，而Bax、Caspase-12表達明顯減少(P<0.01)；且Ⅰ、Ⅱ組神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-12表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax等表達比較

a：P<0.05，與Ⅰ、Ⅱ組比較；b：P<0.05，與Ⅲ組比較。

3 討 論

本研究通過采用阻塞左側(cè)大腦中動脈的方法制備大鼠局灶性腦IRI模型，并于再灌注同時給予吸入高濃度H2，通過觀察大鼠神經(jīng)行為學變化、腦組織形態(tài)學及神經(jīng)細胞凋亡等指標觀察H2對腦IRI的保護作用。實驗結(jié)果表明，H2可明顯降低大鼠腦IRI后NDS評分，降低IRI引起的大鼠腦梗死面積并抑制神經(jīng)細胞凋亡，揭示了H2對大鼠局灶性腦IRI具有明確的保護作用，本研究結(jié)果與既往研究基本一致[3-4]。目前H2發(fā)揮神經(jīng)保護作用的具體機制尚不清楚。有文獻報道H2能通過調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化，進而有效減輕大鼠Aβ1-42 誘發(fā)的神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激，降低8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)、白細胞介素-1β(IL-1β)的水平，同時改善海馬CA1細胞凋亡[5]。此外，Hong等[6]的實驗表明富氫水可抑制大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)引起的神經(jīng)細胞凋亡并改善其神經(jīng)癥狀，其機制可能與通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/絲/蘇氨酸蛋白激酶/糖原合成激酶(PI3K/Akt/GSK3β)信號通路發(fā)揮作用有關(guān)。鑒于以上H2抗細胞凋亡的生物學作用及腦IRI后ERS是啟動細胞凋亡的一種新途徑，本研究擬進一步探討H2對腦IRI的保護作用是否與抑制ERS有關(guān)。

腦IRI發(fā)病因素包括缺血/再灌注過程中出現(xiàn)的ATP耗竭、活性氧自由基(ROS)增多及鈣穩(wěn)態(tài)的破壞等，這些因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白折疊功能受損，使未折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，進而引發(fā)ERS。ERS早期是細胞應(yīng)答刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，過強或持久的ERS可誘導(dǎo)細胞凋亡[7]。有研究表明，抑制過度的ERS能顯著減少細胞凋亡進而抑制細胞IRI[8-9]。GRP78是ERS誘導(dǎo)表達的關(guān)鍵分子伴侶蛋白，作為ERS的標志性保護蛋白，其在蛋白質(zhì)折疊、調(diào)節(jié)ERS跨膜信號蛋白的活性等方面發(fā)揮著重要作用從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷[10]。有研究表明，在缺血低氧、ROS增多、熱休克反應(yīng)等多種應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可激活細胞內(nèi)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR) ，通過激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)作用于GRP78基因的啟動子，上調(diào)GRP78轉(zhuǎn)錄活性，使其表達量增高，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)[11-12]。此外，有研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇可通過增加GRP78表達，減少p-PERK和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)表達，抑制ERS反應(yīng)，從而改善腦IRI大鼠NDS評分，減少梗死體積，對腦IRI起保護作用[13]。本研究結(jié)果顯示，腦IRI后神經(jīng)細胞GRP78表達升高，而吸入H2后GRP78表達量進一步升高，提示了ERS參與了腦IRI過程，且H2能通過上調(diào)GRP78蛋白表達進而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。既往研究表明，在腦IRI過程中，ERS可激活UPR，UPR是由GRP78和雙鏈RNA 激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)和肌醇需要因子1(IRE-1)所介導(dǎo)，PERK、ATF6和IRE-1信號不僅能夠啟動ERS的生存途徑，而且嚴重或持續(xù)的ERS損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的同時，可啟動由ERS所介導(dǎo)的凋亡信號通路，通過激活下游的凋亡信號分子，如CHOP、JNK、Caspase及Bcl-2家族等誘導(dǎo)細胞凋亡[10-13]。Caspase-12是ERS誘導(dǎo)凋亡途徑所固有的，正常情況下其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，處于無活性狀態(tài)。當ERS時，Caspase-12被激活，活化后的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至細胞液，進一步激活Caspase-9，最終激活凋亡執(zhí)行效應(yīng)分子Caspase-3，導(dǎo)致細胞凋亡[14]。細胞凋亡過程是由多種調(diào)節(jié)基因共同參與完成，尤其與一些原癌基因如Bcl-2 和Bax 等密切相關(guān)。研究表明促凋亡因子Bax與ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)[15]。因此，本研究采用Caspase-12、Bcl-2和Bax反應(yīng)大鼠腦IRI后神經(jīng)細胞凋亡情況。

實驗結(jié)果表明，TUNEL染色墨跡顯示凋亡細胞與皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元基本重合，吸入高濃度H2可以明顯減少大鼠腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞凋亡，同時可降低神經(jīng)細胞Caspase-12及Bax蛋白表達，升高GRP78、Bcl-2蛋白表達，從而抑制ERS，對大鼠腦IRI起到明確保護作用。其機制可能是在IRI過程中神經(jīng)細胞能量代謝障礙、大量ROS自由基產(chǎn)生增多及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂等綜合作用下，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊及錯誤折疊蛋白大量聚集，分子伴侶蛋白GRP78即與3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感應(yīng)蛋白PERK、IRE1、ATF6解離,而與未折疊及錯誤折疊蛋白結(jié)合以協(xié)助蛋白的正確折疊，進而減輕ERS，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，從而減少神經(jīng)細胞凋亡。因此，推測H2可能通過激活GRP78蛋白及抑制Caspase-12蛋白的表達，促進細胞未折疊及錯誤折疊蛋白的正確組裝，抑制了ERS；同時通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達及下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達減少神經(jīng)細胞凋亡等有關(guān)。但高濃度H2抑制腦IRI后ERS的具體調(diào)控通路及作用機制尚有待進一步深入研究。

綜上所述，再灌注同時吸入高濃度H2對大鼠局灶性腦IRI可產(chǎn)生明確保護作用，其機制可能與H2可增加腦IRI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78蛋白表達并抑制Caspase-12的激活促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能修復(fù)及抑制ERS，同時通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達及下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達減少神經(jīng)細胞凋亡等有關(guān)。

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Effect of hydrogen gas on endoplasmic reticulum stress and neural cell apoptosis in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury*

XiaYuning1,LiXuemei2,YuanNannan1,ZhangXinlei1,TanYongxing3△

(1.PostgraduateSchool;2.DepartmentofNursing,AffiliatedHospital;3.DepartmentofIntensiveCareMedicine,AffiliatedHospital,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541001,China)

[Abstract] Objective To investigate the effects of inhaling high concentration of hydrogen gas on the expressions of endoplasmic reticulum stress(ERS) related protein glucose regulated protein 78 (GRP78),Caspase-12 and the neural cell apoptosis and related proteins Bcl-2 and Bax in the rats with focal cerebral ischemia reperfusion(I/R) injury.Methods Seventy-two healthy SPF male Sprague-Dawley rats were selected and then randomly divided into the control group(Ⅰ:without any treatment),sham operation group (Ⅱ),cerebral IRI group (Ⅲ) and hydrogen gas treatment group (Ⅳ),18 cases in each group.Focal cerebral ischemia reperfusion injury (IRI) model was induced by using the suture-occluded method.The neurological deficits score (NDS) was assessed at 24 h after cerebral reperfusion in four groups.The cerebral infarction severity and size were detected by TTC staining and neuronal apoptosis of brain cortex were tested by TUNEL technique.The apoptosis index (AI) was calculated.Then the expressions of GRP78,Caspase-12,Bcl-2 and Bax were assessed by Western blot and immunohistochemistry.Results As compared with the group Ⅰand Ⅱ,NDS score,cerebral infarction size,AI and the expressions of GRP78,Caspase-12 and Bax in cerebral cortex in the group Ⅲ and Ⅳ were significantly increased,while the expression of Bcl-2 in cerebral cortex was markedly decreased(P<0.05);compared with the group Ⅲ,NDS score,brain infarction size,AI and the expression of Caspase-12 and Bax in cerebral cortex in the group Ⅳ were markedly decreased,while the expressions of GRP78 and Bcl-2 were dramatically increased (P<0.05).Conclusion Inhaling high concentration of hydrogen gas has a certain protective effect on cerebral IRI in rats through increasing endoplasmic reticulum GRP78 protein expression after IRI and inhibiting Caspase-12 activation,thus inhibiting ERS and promoting the repair function of endoplasmic reticulum.

hydrogen;brain ischemia;reperfusion injury;apoptosis;endoplasmic reticulum;stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.003

國家自然科學基金資助項目(81260206)；廣西壯族自治區(qū)自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019155，2015GXNSFAA139130)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳課題(Z2009038，Z2013497，Z2012402)；廣西醫(yī)學科學實驗中心開放課題(KFJJ2011-07)。 作者簡介：夏裕寧(1987-),在讀碩士研究生,主要從事圍術(shù)期臟器功能保護的基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail:tanyongxing24@163．com。

R743.31

A

1671-8348(2017)09-1159-04

2016-07-18

2016-11-16)