吸煙誘導(dǎo)肺氣腫大鼠血清AECA的表達(dá)及甲基波尼松龍的干預(yù)影響*

張 璐，王中新，馬 麗，張 程，張湘燕

(貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴陽 550002)

·論 著·

吸煙誘導(dǎo)肺氣腫大鼠血清AECA的表達(dá)及甲基波尼松龍的干預(yù)影響*

張 璐，王中新，馬 麗△，張 程，張湘燕

(貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴陽 550002)

[摘要] 目的 探討吸煙誘導(dǎo)肺氣腫大鼠血清抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)的表達(dá),分析甲基波尼松龍對其干預(yù)影響。方法 將39只大鼠隨機(jī)分為對照組、吸煙大鼠肺氣腫模型組(模型組)、甲基波尼松龍干預(yù)組(干預(yù)組)。模型組及干預(yù)組進(jìn)行煙霧暴露被動吸煙1個月時，對干預(yù)組腹腔注射甲基波尼松龍(每天1次，每周6 d)。煙霧暴露90 d 后，比較各組大鼠血清AECA、支氣管肺泡灌洗液(BACF)中白細(xì)胞介素-8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及肺組織中肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)、平均肺泡數(shù)(MAN)的差異。結(jié)果 模型組血清AECA比對照組、干預(yù)組升高(P<0.05)；模型組BALF中IL-8、TNF-α、MMP-9 水平較對照組、干預(yù)組均升高(P<0.05)。結(jié)論 AECA參與吸煙誘導(dǎo)肺氣腫大鼠形成，甲基波尼松龍可降低AECA及細(xì)胞炎癥因子水平，并影響肺氣腫的形成。

肺氣腫；甲基波尼松龍；抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體；支氣管肺泡灌洗液；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素8;基質(zhì)金屬蛋白酶9

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，病死率較高，并給患者及其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。該病是一種以持續(xù)氣流受限為特征的，同時也可以預(yù)防和治療的疾病，其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[1]。當(dāng)前，該病發(fā)病機(jī)制機(jī)制尚未完全清楚，治療效果不盡人意。COPD患者肺內(nèi)炎癥細(xì)胞以肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞為主，激活的炎癥細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)，包括白三烯B4、白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[1]。越來越多的研究結(jié)果表明，自身免疫反應(yīng)、肺泡隔細(xì)胞凋亡在肺氣腫甚至COPD 的形成過程中具有重要的作用[2]，被認(rèn)為是解釋COPD發(fā)病的新的機(jī)制，因此越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和重視。

抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)是一組針對血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)抗原的異質(zhì)性抗體，它可出現(xiàn)在多種自身免疫疾病當(dāng)中[2]。說明該抗體的產(chǎn)生可能是誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的重要因素之一，許多研究表明COPD的形成也和自身免疫反應(yīng)有關(guān)[3-5]，尤其是有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)在終末期肺氣腫患者血清中檢測到AECA[6]。有研究證明，COPD發(fā)病和AECA有關(guān)，故由此可推測，AECA 亦有可能在肺氣腫形成中起著重要作用，而且和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。大量的事實(shí)證明COPD急性加重期患者在標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素能夠更快地緩解癥狀、減緩肺功能下降[7]。因此，結(jié)合上述相關(guān)內(nèi)容，可進(jìn)一步推測：皮質(zhì)類固醇激素有可能通過抑制AECA的表達(dá)，阻斷其誘發(fā)的自身免疫機(jī)制、氣道炎癥反應(yīng)從而達(dá)到防止肺氣腫發(fā)生的可能。為此，本實(shí)驗(yàn)通過建立吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫大鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證AECA在肺氣腫發(fā)病中的作用并探討其相關(guān)機(jī)制，以期為完善肺氣腫的發(fā)病機(jī)制及尋求可能的治療途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠39只，4～5周齡，體質(zhì)量200～250 g，由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供(近交系，清潔級)，貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。(2)儀器和試劑：煙霧暴露箱(自制)，550酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，DL-5低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(0LYBUS BX41TF日本)，-80 ℃冰箱(Thermo Fisher Seientific公司美國)，血清AECA ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)ELISA(武漢博士德生物工程有限公司)，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(美國輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)批號：H20080284)，雄獅牌香煙(浙江中煙有限責(zé)任公司，焦油量每盒9 mg)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法將39只將大鼠隨機(jī)分為對照組、吸煙大鼠肺氣腫模型組(模型組)、甲基波尼松龍干預(yù)組(干預(yù)組),每組13只。

1.2.2 COPD模型建立及動物處理 方法參照文獻(xiàn)[8]，將模型組及干預(yù)組放入自制的大鼠實(shí)驗(yàn)性被動吸煙裝置中，點(diǎn)燃5支香煙后放入箱內(nèi)自然燃燒，至香煙燃盡，煙霧消失，共計15 min，此為1次煙霧暴露，5 min后重復(fù)1次煙霧暴露，3 h后重復(fù)上述2次煙霧暴露。每天共煙霧暴露4次，每周6 d。煙霧暴露達(dá)1 個月時，干預(yù)組大鼠按照文獻(xiàn)[9]報道的劑量給予甲基波尼松龍生理鹽水溶解液(10 mg·kg-1·d-1)腹腔注射，每周6 d。第90天后終止所有處理并進(jìn)行以下檢測。

1.2.3 標(biāo)本采集 末次煙霧暴露24 h后，參照文獻(xiàn)[10]予10%水合氯醛(0.3 mL/100 g，腹腔注射)麻醉大鼠后，剖腹下腔靜脈抽取靜脈血，在5 ℃、2 000 r/min離心10 min，留取血清，-70 ℃冰箱中保存待測。隨后，處死大鼠，暴露氣管與雙肺，將右主支氣管的結(jié)扎解除，將尖端磨平的12 號針頭連接于5 mL注射器，經(jīng)氣管切口向左肺緩慢注入無菌生理鹽水3 mL，每次注入后立即回吸灌洗液(回收率為80%～90%)，并經(jīng)紗布過濾，重復(fù)3 次[8]。吸取各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心，取其上清液移入無菌瓶內(nèi)，-70 ℃冰箱中待測。結(jié)扎大鼠左主支氣管及右中上肺支氣管，4%多聚甲醛固定液注入右下肺灌注，直至胸膜展平，右下肺膨脹邊緣變銳，30 min后取出右下肺并置入4%多聚甲醛中固定24 h。最后石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察HE染色的肺組織。

1.2.4 細(xì)胞因子的檢測 采用ELISA檢測血清AECA及BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行。

1.2.5 病理標(biāo)本形態(tài)定量分析 在光鏡(×100)下觀察，每只大鼠肺組織標(biāo)本取3個切片，每片取3個視野。形態(tài)分析，在每個視野下正中心劃十字交叉線，測出十字線總長(L)和每個視野面積(S)，計算與交叉線相交的肺泡隔數(shù)(NS)和每個視野內(nèi)肺泡數(shù)(Na)，平均內(nèi)襯間隔(MLI)=L/NS，MLT表示肺泡平均內(nèi)徑。平均肺泡數(shù)(MAN)=Na/S，MAN用來反映肺泡密度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 3組大鼠在造模前外觀、行為、對刺激的反應(yīng)及活動比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后，對照組大鼠的一般指標(biāo)與造模前比較無明顯變化；模型組在造模過程中，出現(xiàn)毛發(fā)脫落、萎黃、牙齒偏黃、反應(yīng)遲鈍、活動減少、呼吸頻率增快。干預(yù)組在煙霧暴露過程中，首先大鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落、反應(yīng)遲鈍，但在煙霧暴露30 d后予甲基潑尼松龍琥珀酸鈉(10 mg·kg-1·d-1)腹腔內(nèi)注射，隨后大鼠毛發(fā)、反應(yīng)及活動度較前好轉(zhuǎn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠第60、72天時各死亡1 只，干預(yù)組第70 天時死亡1 只，原因不詳；對照組無動物死亡。

2.2 各組大鼠BALF中TNF-α、MMP-9及IL-8水平比較 模型組及干預(yù)組大鼠BALF中TNF-α、MMP-9、IL-8水平均高于對照組(P<0.05)；但干預(yù)組BALF中TNF-α、MMP-9、IL-8水平低于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠BALF中TNF-α、MMP-9及IL-8水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.3 各組大鼠血清中AECA水平比較 模型組、干預(yù)組血清中AECA水平分別為(149.51±3.55)、(121.49±4.86)ng/L，均高于對照組的(91.27±4.60)ng/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但干預(yù)組血清中AECA水平低于模型組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠肺組織HE染色切片病理學(xué)變化 顯微鏡下，對照組中肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔完整，氣管壁結(jié)構(gòu)清楚，氣管內(nèi)表面纖毛豐富、整齊，未見脫落現(xiàn)象。模型組的大鼠支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)較多的慢性炎性細(xì)胞浸潤，纖毛脫落、倒?fàn)?，呈杯狀上皮?xì)胞化生，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡；在上述變化中，干預(yù)組較模型組都相對減輕。與對照組比較，模型組大鼠MLI明顯增加，MAN明顯減小，表現(xiàn)為明顯的肺氣腫樣改變，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，干預(yù)組大鼠MLI 明顯減小，MAN明顯增加(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠MLI及MAN比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

AECA是一組針對血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)抗原的異質(zhì)性抗體[11]。AECA能夠識別在人體內(nèi)皮細(xì)胞的多種抗原決定簇，雖然它們的靶抗原和精確的致病作用仍不清楚，但它們結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜抗原，能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致血管損傷[12]。近幾年，自身免疫機(jī)制已經(jīng)被確認(rèn)為是COPD發(fā)病機(jī)制之一[6,13-16]。AECA已在COPD患者中被檢測出[3-4]。在動物模型中進(jìn)行誘導(dǎo)肺氣腫，內(nèi)皮細(xì)胞是其中的一個靶細(xì)胞。因此，作者推測，AECA參與COPD的發(fā)病。本課題組前期研究表明，COPD患者血清中發(fā)現(xiàn)AECA的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)COPD患者較正常對照人群血清AECA水平顯著增高[2]。有研究發(fā)現(xiàn)在非COPD患者或不吸煙患者中，該水平呈低表達(dá)或不表達(dá)[17]。

本實(shí)驗(yàn)采用肺氣腫大鼠模型，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組血清中AECA水平較對照組明顯升高。結(jié)合前述文獻(xiàn)支持AECA在吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫發(fā)病中有重要意義。目前國內(nèi)外較多研究表明TNF-α、IL-8 和MMP-9 可參與吸煙誘發(fā)的肺氣腫形成[18-20]。本實(shí)驗(yàn)表明，模型組大鼠BALF中IL-8、TNF-α、MMP-9 水平明顯高于對照組。和前述文獻(xiàn)報道一致，支持上述炎癥因子在吸煙誘發(fā)的肺氣腫形成的重要作用。

皮質(zhì)醇類固醇能抑制花生四烯酸的代謝，減少白三烯和列腺素的合成，抑制炎癥細(xì)胞的定向移動，活化并提高呼吸道平滑肌β受體的反應(yīng)性等[21]。能夠抑制炎性因子合成，如IL-1、IL-3、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8及TNF-α的合成分泌，而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的凋亡等。較多研究表明伴隨有AECA升高的自身免疫性疾病對皮質(zhì)醇類固醇治療反應(yīng)良好,而大量的臨床事實(shí)證明COPD急性加重期患者在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上加糖皮質(zhì)激素可緩解癥狀，減慢肺功能下降[8]。因此，皮質(zhì)醇激素有可能通過抑制AECA的表達(dá)，阻斷其誘發(fā)的自身免疫機(jī)制、氣道炎癥反應(yīng)從而防止肺氣腫發(fā)生可能。

本實(shí)驗(yàn)表明，甲基波尼松龍干預(yù)后大鼠血清中AECA水平較模型組顯著降低，可說明甲基波尼松龍可干預(yù)AECA表達(dá)，從而對COPD治療起一定作用。干預(yù)組BALF中TNF-α、IL-8、MMP-9水平較模型組降低。本研究旨在探討AECA在肺氣腫形成中的作用及其相關(guān)機(jī)制，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AECA與吸煙誘發(fā)的肺氣腫形成；甲基波尼松龍可降低細(xì)胞炎癥因子水平而干預(yù)肺氣腫的形成。進(jìn)一步了解肺氣腫的發(fā)病機(jī)制，為臨床上尋求新的治療方法提供了理論指導(dǎo)。

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Expression of serum anti-endothelial cell antibody in emphysema rats induced by smoking and intervention effect of methylprednisolone*

ZhangLu,WangZhongxin,MaLi△,ZhangCheng,ZhangXiangyan

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China)

[Abstract] Objective To investigate the expression of anti-endothelial cell antibody AECA in the emphysema rats induced by smoking and to analyze the intervention effect of methylprednisolone on it.Methods Thirty-nine rats were randomly divided into the control group，smoking rat emphysema model group(model group) and methylprednisolone intervention group(intervention group).The model group and intervention group conducted the 1-month passive smoking by smog exposure.The intervention group was intraperitoneally injected by methylprednisolone (once daily,6 d per week).After exposing to smog for 90 d,the differences of serum AECA level,IL-8,MMP-9 and TNF-α level in bronchoalveolar lavage fluid(BALF),lung MLI and mean alveolar number (MAN) were compared among groups.Results Compared with the control group and theintervention group,the level of serum AECA in the model group was significantly increased (P<0.05);Compared with the control group and intervention group,the IL-8,TNF-α and MMP-9 levels of BALF in the model group were also increased(P<0.05).Conclusion ACEA participates in the smoking induced emphysema formation;methylprednisolone may decrease the level of AECA and cell inflammatory factors and affects the emphysema formation.

pulmonary emphysema;methylprednisolone;anti-endothelial cell antibodies;bronchoalveolar lavage fluid;tumor necrosis factor-alpha;interleukin-8;matrix metalloproteinase 9

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060006)；十二五國家科技支撐計劃課題資助項(xiàng)目(2013bai09b09)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合j字(2011)2251]。 作者簡介：張璐(1986-)，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事慢性阻塞性肺疾病的診治研究。△

，E-mail：maligy@126.com。

R563.3

A

1671-8348(2017)09-1156-03

2016-08-30

2016-11-15)