決奈達隆對新生大鼠心室肌細胞HCN通道mRNA和蛋白表達的影響*

陳琳琳，范新榮，李 濤，李 光，李妙齡，歐賢紅，蘭 歡，黃夢穎，曾曉榮

(西南醫科大學醫學電生理學省部教育部重點實驗室/四川省心血管疾病防治協同創新中心，四川瀘州 646000)

·論 著·

決奈達隆對新生大鼠心室肌細胞HCN通道mRNA和蛋白表達的影響*

陳琳琳，范新榮，李 濤，李 光，李妙齡，歐賢紅，蘭 歡，黃夢穎，曾曉榮△

(西南醫科大學醫學電生理學省部教育部重點實驗室/四川省心血管疾病防治協同創新中心，四川瀘州 646000)

[摘要] 目的 通過檢測新生大鼠心室肌細胞在給予藥物決奈達隆前后超極化激活環核苷酸門控陽離子通道(HCN通道) mRNA和蛋白水平的變化，探討決奈達隆對HCN通道表達的影響。方法 分離新生SD大鼠心室肌，Ⅱ型膠原酶消化，通過差速貼壁分離法收集獲得單一的心室肌細胞。并根據濃度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L的決奈達隆對細胞進行處理48 h)和時間(濃度為10 μmol/L的決奈達隆對細胞進行1、6、12、24、48 h的處理)梯度分組。采用實時熒光定量PCR法和Western blot檢測HCN2、HCN4通道mRNA水平和蛋白水平。結果 濃度梯度組和時間梯度組的HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達水平均低于對照組(P<0.05)；與對照組比較，10 μmol/L決奈達隆處理后12 h組的蛋白水平明顯下調(P<0.01)。結論 決奈達隆可抑制HCN2、HCN4通道mRNA和蛋白的表達，且作用呈濃度依賴性，在給藥后12 h達到最大作用。

決奈達隆；超極化激活環核苷酸門控陽離子通道；RNA，信使；蛋白質類

超級化激活環核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated，HCN)是心肌電重構中的重要離子通道[1],現有多個研究已表明HCN通道表達上的變化在心律失常的發生和維持中起著重要的作用[2-6]。決奈達隆(Dronedarone),即N-{2-丁基-3-[4-(3-二丁基氨基丙醇)苯甲酰] -5-苯并呋喃基}甲基磺酰胺(IUPAC)(SR33589)，是一類苯并呋喃的衍生物，與胺碘酮在結構上很相似，臨床藥理證實決奈達隆對機體甲狀腺沒有毒性損害，被認為是較為理想的抗心律失常藥物。本文通過檢測HCN通道的mRNA和蛋白表達的變化，探討決奈達隆對HCN通道表達的影響，為心律失常尋求更有效的防治方法奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：1～3 d新生健康清潔級SD大鼠,雌雄不限(共10批，每批8只)，購自西南醫科大學實驗動物中心[SCXK(川) 2013-17]。(2)試劑：鹽酸決奈達隆購自selleckchem公司，超純RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自康為世紀公司，SYBR Green 定量PCR反應試劑盒購自QIAGEN公司，DMEM培養基、胎牛血清購自Hyclone公司，實驗中涉及的生化試劑均為分析純產品。(3)儀器：冷凍高速離心機購自Thermo Fisher公司，PCR儀、實時定量PCR儀購自Applied Biosystems公司，紫外分光光度計購自NanoDrop公司，凝膠成像分析系統購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠心肌的制備與培養 取1～3 d新生健康清潔級SD大鼠，參考文獻[7]分離原代乳鼠心肌細胞，通過差速貼壁分離法收集獲得單一的心室肌細胞。上述所得細胞于37 ℃、5%CO2敷育箱中培養以備分子生物學實驗用。

1.2.2 決奈達隆用藥方法 決奈達隆不易容易水，故選擇二甲基亞砜(DMSO)配置10 mmol/L的決奈達隆溶液，實驗時根據所需濃度稀釋到細胞外液中，為了不影響細胞膜離子通道功能，使DMSO濃度均低于0.1%。

1.2.3 動物分組 將75只新生大鼠根據藥物處理分為濃度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L的決奈達隆對細胞進行處理48 h)和時間(濃度為10 μmol/L的決奈達隆對細胞進行1、6、12、24、48 h的處理)梯度分組，另設對照組和實驗組，每組5只。

1.2.4 實時熒光定量PCR實驗方法 (1)總RNA提取：按照康為世紀公司的超純RNA提取試劑盒操作，提取心肌細胞總RNA，紫外分光光度計檢測吸光度(OD)值，OD260/OD280均為1.8～2.0，記錄總RNA濃度。(2)引物設計：根據Gene Bank中公布的HCN2，HCN4基因序列設計引物，選擇β-actin基因作為內參基因，引物序列見表1。(3) RT-PCR擴增：①逆轉錄合成cDNA。按照康為世紀逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，取總RNA為500 ng，逆轉錄的反應體系為20 μL。反應條件，42 ℃ 孵育50 min，80 ℃孵育5 min，4 ℃冷卻。合成后的cDNA置于-20 ℃冰箱備用。②實時熒光定量PCR反應。按照SYBR Green 定量PCR反應試劑盒(QIAGEN公司)進行實驗，取cDNA 2 μL，反應體系為20 μL。熒光定量PCR反應條件，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s,60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s,共40個循環。獲取實驗數據，比較各濃度組和各時間組與對照組之間HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達的差異。采用2-ΔΔCt分析各個濃度和時間決奈達隆對HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達的影響(將不做藥物處理和時間處理的定義為對照組，對照組基因相對表達量為1)。

表1 HCN2、HCN4及β-actin基因引物序列

1.2.5 Western blot實驗方法 實驗各組與對照組細胞中HCN2、HCN4蛋白檢測，依據細胞的密度加入相應量的Lysis buffer裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min后，細胞超聲粉碎儀處理1 min，在4 ℃低溫離心機中12 000 r/min離心15 min,取得上清液為提取的心肌細胞總蛋白，置于新的EP管中備用。同時取少量上清液，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒，按照使用說明測定蛋白質水平。制備分離膠、濃縮膠，上樣，電泳。將電泳后凝膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，ECL 顯色曝光。采用Quantity One 軟件分析處理所得圖像。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。Western blot實驗以10 μmol/L的決奈達隆對細胞進行處理12 h為實驗組。

2 結 果

2.1 各濃度梯度組與對照組HCN2 mRNA和HCN4 mRNA水平比較 HCN2 mRNA和HCN4 mRNA水平在各濃度藥物處理之后表達均有下調，且存在濃度依賴性。各濃度梯度組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2 各時間梯度組與對照組HCN2 mRNA和HCN4 mRNA水平比較 HCN2 mRNA和HCN4 mRNA在各個時間經過藥物處理后，表達均有下調，且在12 h時藥物作用發揮到最大,對HCN通道抑制作用最大。各時間梯度組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 各濃度組與對照組HCN通道基因相對表達量比較

a：P<0.05；b：P<0.01，與對照組比較。

表3 各時間組與對照組HCN通道基因相對表達量比較

a：P<0.05；b：P<0.01，與對照組比較。

2.3 實驗組與對照組大鼠HCN2、HCN4蛋白相對表達量比較 與對照組比較，實驗組大鼠HCN2、HCN4蛋白相對表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1、表4。

圖1 實驗組與對照組Western blot檢測

表4 兩組大鼠HCN2、HCN4蛋白相對表達量比較

a：P<0.01，與對照組比較。

3 討 論

HCN通道是電壓門控性陽離子通道，并且是心肌電重構中重要的離子通道，在心律失常中起著非常重要的作用。利用實時熒光定量PCR與cDNA庫掃描技術在哺乳類克隆到4個異構型(HCN1～HCN4)，僅在心臟發現HCN1、HCN2和HCN4的表達[8]。人類正常心肌細胞的HCN通道多是HCN2或者HCN4組成的異元多聚體，而HCN1并非主要的通道亞型[9]。其中HCN2參與了心臟起搏，并且維持心臟穩定的起搏節律[2-3],基本表達在非自發活動的心肌細胞中[4]；HCN4則參與維持基礎心率和產生正常的起搏電位[5-6]，表達在傳導系統中具有自發活動的細胞中[4]。有研究通過收集臨床患者心肌標本，應用實時熒光定量PCR方法，檢測房顫組與竇性心律組HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達水平，結果房顫組的HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達水平均有增加[10-11]。Lai等[12]在對人類左右心房及心耳組織的研究中發現，HCN通道在慢性心房顫動患者的心肌組織中表達明顯高于竇性心律的患者。Stillitano等[13]研究發現，在晚期缺血性心肌病患者的心肌細胞中，HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表達水平相比對照組是顯著增加的，HCN通道的表達變化可能是心力衰竭心律失常的內在機制。有實驗證明，HCN2、HCN4在心房和心室中均有表達，且與臨床常見心律失常相關[4-5,10-11]。

決奈達隆為Ⅲ類抗心律失常藥物,與胺碘酮一樣，是一種多通道阻滯劑，可表現出Ⅰ～Ⅳ類抗心律失常藥物的電生理作用[14]。Verrier等[15]以豬為實驗對象建立房顫模型，實驗發現決奈達隆可有效降低心室率22.1%，提高 PR間期8.7%、QT間期3.3%，心房有效不應期(AERP)、心室有效不應期(VERP)分別提高6.2%和11.7%。胺碘酮作為器質性心臟病患者出現室性心動過速時的首選藥物，與之比較，決奈達隆不僅在室性心律失常中治療作用相當，在治療房性心律失常方面也有明顯的作用，而且因為其不含碘，減小了對患者甲狀腺及甲狀腺激素的影響，不良反應小，更適合作為臨床心律失常用藥。李紅霞等[16]研究發現胺碘酮呈濃度和時間依賴性降低乳鼠心室肌細胞HCN2和HCN4的mRNA水平，作者推測與胺碘酮同為苯并呋喃衍生物的決奈達隆可能通過抑制HCN2和HCN4通道表達從而發生抗心律失常作用。

本研究以新生大鼠心室肌細胞為研究對象，運用實時熒光定量PCR技術檢測決奈達隆對HCN2 mRNA、HCN4 mRNA表達的影響，實驗發現決奈達隆對HCN通道基因有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，其中用濃度為20 μmol/L的決奈達隆對心室肌細胞進行細胞培養處理48 h后，通過顯微鏡觀察到部分細胞壞死，細胞體積縮小，連接消失，與周圍細胞脫離，考慮是藥物濃度過高，對細胞有不良反應，故在時間梯度中采用了10 μmol/L濃度的決奈達隆對心室肌細胞進行處理,實驗發現決奈達隆作用于新生大鼠心室肌后12 h，對HCN通道的抑制作用達到最強，12 h后隨著時間增加，抑制作用逐漸減弱，出現該現象考慮是細胞對藥物的代謝作用。Western blot實驗以10 μmol/L濃度的決奈達隆對細胞進行處理12 h為實驗組，結果也證實了決奈達隆可顯著抑制新生大鼠心室肌HCN2、HCN4的蛋白的表達。

決奈達隆可抑制新生大鼠心室肌HCN通道mRNA水平和蛋白水平的表達，這為決奈達隆應用于臨床心律失常奠定了理論基礎。研究報道決奈達隆可用于房性心律失常，但本實驗不足之處只以心室肌細胞作為研究對象，對于最終明確決奈達隆對心房肌細胞上的HCN通道是否仍然有明顯的抑制作用和決奈達隆是否可應用于臨床常見的房顫等惡性房性心律失常疾病還需進一步研究。

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Effect of dronedarone on HCN channel mRNA and protein expression in neonatal rat ventricular myocytes*

ChenLinlin,FanXinrong,LiTao,LiGuang,LiMiaoling,OuXianhong,LanHuan,HuangMengying,ZengXiaorong△

(KeyLaboratoryofMedicalElectrophysiologyofMinistryofEducation,CollaborativeInnovationCenterforPreventionandTreatmentofCardiovascularDisease/InstituteofCardiovascularResearch,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract] Objective To explore the effect of dronedaronel on hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated(HCN) channel expression by detecting the change of HCN channel mRNA and protein level before and after giving dronedarone in neonatal rat ventricular myocytes.Methods Neonatal rat ventricular myocytes were separated and digested by type Ⅱ collagenase,and then single ventricular myocytes were collected through differential sticking wall separation method.According to the concentrations(0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,20.0 μmol/L of dronedaronel for treating myocytes for 48 h ) and time(10 μmol/L of dronedaronel for treating myocytes for 1,6,12,24,48 h)the gradient grouping was conducted.The levels of HCN2 and HCN4 channel mRNA and protein level were determined by real-time PCR and Western blot.Results The HCN2 mRNA and HCN4 mRNA expression levels in concentration gradient group and time gradient group were lower than those in the control group(P<0.05);compared with the control group,the protein level in the 10 umol/L dronedaronel treatment for 12 h group was significantly down-regulated(P<0.01).Conclusion Dronedaronel could inhibit the expression of HCN2/HCN4 channel mRNA and protein,moreover its action shows the concentration dependency and reaches the maximum at 12 h after medication.

dronedarone;hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated;RNA,messenger;proteins

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.001

國家自然科學基金資助項目(81500259)。 作者簡介：陳琳琳(1990-),在讀碩士研究生，主要從事生理學研究。△

，E-mail：Zengxiaorong8818@163.com。

R319

A

1671-8348(2017)09-1153-03

2016-08-28

2016-11-13)