SFRP2在抑制宮頸癌細胞株的增殖作用研究

蘭 健，劉曉云，劉虹嵐

(貴州省遵義市第一人民醫院婦產科 563002)

SFRP2在抑制宮頸癌細胞株的增殖作用研究

蘭 健，劉曉云△，劉虹嵐

(貴州省遵義市第一人民醫院婦產科 563002)

[摘要] 目的 了解SFRP2在人宮頸癌組織中的表達變化，探討SFRP2對宮頸癌細胞增殖的影響。方法 采用Western bolt及qRT-PCR檢測SFRP2在宮頸癌組織中的表達；用慢病毒構建過表達SFRP2的人宮頸癌細胞株，并用CCK-8及平板克隆分析SFRP2對細胞增殖的影響；Western bolt和qRT-PCR檢測SFRP2在腫瘤細胞內對WNT通路的相關蛋白和基因表達的影響。結果 與癌旁組織相比，SFRP2在人宮頸癌組織中低表達；過表達SFRP2的宮頸癌細增殖受抑制；SFRP2抑制細胞增殖是通過WNT信號通路而發生。結論 SFRP2作為宮頸癌新的候選基因作用有待深入研究。

SFRP2；宮頸腫瘤；增殖；WNT信號通路

宮頸癌是目前病死率較高的一種女性生殖系統腫瘤，嚴重威脅婦女的生命和健康[1]。隨著對宮頸癌的認識不斷深入，診療方法發展，然而患者生存期仍不佳。因此，從分子水平探索宮頸癌的發生、發展機制，爭取宮頸癌的早期診治，對改善患者的預后有重要的意義。SFRP2基因屬于編碼SFRP家族的一個成員，其含有一個富含半胱氨酸的同源Frizzled蛋白，后者為公認的WNT結合位點[2]。SFRPs是一種WNT通路的抑制分子，可以負向調節WNT信號通路[3]，抑制許多腫瘤的增殖、侵襲轉移及增加腫瘤的凋亡[4]。因此，作者推測在宮頸癌組織中SFRP2的表達也可能發生變化，并可能參與調控宮頸癌細胞的生物學行為。為驗證上述假設，本研究擬在宮頸癌及癌旁組織中檢測SFRP2的表達變化， 探索SFRP2對宮頸癌細胞增殖的影響及其機制，為臨床提供宮頸癌治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 宮頸癌及癌旁組織來源于本院婦產科2015年1月至2015年6月切除的、初診為原發性宮頸癌的住院患者4例，年齡55～70歲，平均年齡61歲，已獲患者知情同意及本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HeLa和C-33A人宮頸癌細胞均購自中國科學院細胞庫，使用DMEM培養基(GIBCO公司)，10%胎牛血清(FBS，GIBCO公司)。在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。取對數期生長良好的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染及穩轉細胞系的構建 利用PCR的方法克隆人SFRP2的全長編碼序列并構建表達載體pcDNA3.1-SFRP2。利用用慢病毒將表達載體及空載轉入宮頸癌細胞株HeLa和C-33A。利用G418篩選單克隆細胞，建立SFRP2基因穩定高表達及空載體，并分別命名為Lv-SFRP2組(轉染過表達SFRP2病毒的HeLa和C-33A細胞)，對照組(轉染空載體的HeLa和C-33A細胞)及Blank組(未轉染病毒的野生型HeLa和C-33A細胞)。

1.2.3 CCK-8細胞增殖檢測 取2 000個/孔對數生長期的細胞接種于96孔培養板，設3個復孔，并設立空白對照。孵育0、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8(日本同仁公司)，繼續孵育1 h后，用自動酶標儀以450 nm波長檢測各孔吸光度(A)值，取復孔吸光度平均值進行比較。為研究SFRP2對宮頸癌細胞增殖能力的影響，采用CCK-8法檢測SFRP2正常表達與過表達時HeLa和C-33A細胞增殖能力的變化。

1.2.4 平板克隆形成檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，接種于6孔培養板中，每孔500個細胞。加入細胞的培養基，每組設3個復孔。然后將培養板移入37 ℃孵育箱中孵育12 d左右。4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min。顯微鏡下觀察、拍照，并計算其克隆形成數(含50個細胞以上的集落為1個克隆)。

1.2.5 Western blot檢測 細胞增殖匯合達80%時棄去培養基，冷PBS洗2遍，細胞直接刮下吸入1．5 mL無酶離心管，加入裂解液RIPA(提前加人終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF)200 ixL，冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液至1.5 mL無酶離心管中，用BCA法做標準曲線測蛋白濃度，10%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗于4 ℃孵育過夜(SFRP2，total-β-catenin，c-myc和Cyclin D1抗體購買于Abcam公司，active-β-catenin抗體購買于Millipore公司)，TBST洗膜3次，二抗(1∶2 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發光試劑發光。為闡明SFRP2對宮頸癌細胞增殖的作用機制。用Western blot檢測宮頸癌細胞株(HeLa和C-33A)用過表達SFRP2時對WNT信號通路的變化、c-myc的變化及周期相關蛋白Cyclin D1的變化。

1.2.6 RT-PCR檢測 用TRIzol法提取RNA(TRIzol購于Invitrogen公司)，反轉錄合成cDNA(反轉錄試劑盒primeScriptTMRT kit購于寶生物公司)，以其為模板，用SYBR premix Ex TaqTMGreen Ⅱ(購于Takara公司)在Real-time PCR系統上(BioRad,Hercules,CA,USA)檢測靶基因的mRNA水平。c-myc引物(上游：5′-CCT GGT GCT CCA TGA GGA GAC-3′，下游：5′-CAG ACT CTG ACC TTT TGC CAG G-3′)Cyclin D1引物(上游：5′-TCT ACA CCG ACA ACT CCA TCC G-3′，下游：5′-TCT GGC ATT TTG GAG AGG AAG TG-3′)及內參β-actin的引物(上游：5′-CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′，下游：5′-AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T-3′)。用qRT-PCR檢測宮頸瘤細胞株(HeLa 和C-33A)過表達SFRP2時對c-myc和周期相關蛋白Cyclin D1的mRNA的變化。

2 結 果

2.1 SFRP2在宮頸癌組織及癌旁組織中的mRNA和蛋白表達水平比較 宮頸癌組織中SFRP2的mRNA和蛋白水平均較癌旁組織明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A：SFRP2的mRNA表達；B：SFRP2的蛋白表達；P：癌旁組織；T：宮頸癌；a:P<0.05，與癌旁組織比較。

2.2 宮頸癌細胞株HeLa和C-33A中SFRP2的過表達效果鑒定 在宮頸癌組織中，SFRP2的mRNA及蛋白水平均低于癌旁組織。在HeLa和C-33A細胞中，相比于Blank組，對照組的SFRP2的mRNA和蛋白表達水平并無明顯變化；而Lv-SFRP2組SFRP2的表達水平較Blank組及對照組細胞明顯升高(P<0.05)，見圖2。

2.3 CCK-8檢測宮頸癌細胞株HeLa和C-33A中SFRP2的過表后增殖的影響 在4 d的培養中，Blank組和對照組的增殖能力并沒有發生明顯改變，但SFRP2過表達Lv-SFRP2組細胞增殖能力明顯低于前兩組，見圖3。

2.4 平板克隆檢測宮頸癌細胞株HeLa和C-33A中SFRP2的過表后增殖的影響 平板克隆形成實驗檢測SFRP2對宮頸癌細胞增殖能力的影響，結果顯示，Blank組和對照組的增殖能力沒有發生明顯改變，而在SFRP2過表達的Lv-SFRP2組細胞增殖能力明顯低于前兩組，見圖4。

A：轉染病毒后HeLa 和C-33A細胞SFRP2的蛋白表達；B：轉染病毒后HeLa 和C-33A細胞的mRNA表達；1：Blank組；2：對照組；3：Lv-SFRP2組；a：P<0.05，與Lv-SFRP2組比較。

a：P<0.05，與0、1 d比較。

1：Blank組；2：對照組；3：Lv-SFRP2組；a：P<0.05，與Lv-SFRP2組比較。

2.5 SFRP2對宮頸癌細胞的抑制作用 WNT信號被激活后，c-myc蛋白表達降低，Cyclin D1蛋白表達減少；c-myc和Cyclin D1的mRNA表達減少，見圖5。

a-β-catenin：激活型的β-catenin;t-β-catenin：總的β-catenin;1：Blank組；2：對照組；3：Lv-SFRP2組；a：P<0.05，與Lv-SFRP2組比較。

3 討 論

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的惡性腫瘤[5]，嚴重危害女性健康。據統計，全世界每年有20多萬婦女死于宮頸癌[6]。而宮頸癌的發生、發展是多因素共同作用下的結果，由于目前有關調控宮頸癌發生、發展的分子機制尚未完全闡明，用以指導臨床的研究更為缺乏，所以中晚期宮頸癌的療效不佳。因而，探討宮頸癌發生、發展的分子機制，尋找宮頸癌治療靶點，對于提高宮頸癌的療效具較大的臨床意義與社會價值。

SFRP2屬于一種分泌型卷曲相關蛋白族組成的SFRPs，該家族主要成員包括SFRP1～5，均為WNT/β-catenin信號通路的抑制蛋白[7-8]。眾所周知，WNT信號通路在腫瘤的發生、胚胎發育和神經退行性疾病均發揮著重要的作用[9]，并已被廣泛的在人類癌癥研究。 研究表明，WNT信號通路在非小細胞肺癌(NSCLC)[10]和白血病[11]等多種人類腫瘤中被異常激活。有研究報道，SFRP2可通過影響SLUG、TWIST和 SNAIL這3個參與上皮間質轉化(EMT)的轉錄因子，從而增加上皮細胞的標志物E-cadherin的表達，最后抑制宮頸癌的侵襲轉移[12]。Luo等[13]研究發現，在黑色素癌中SFRP2啟動子發生甲基化，造成該基因表達降低，激活WNT通路；使用DNA甲基化抑制劑后，SFRP2表達增加，并可促進黑色素瘤的侵襲轉移能力。此外，Xiao等[14]在口腔鱗狀細胞癌中研究發現，SFRP2的mRNA水平較癌旁減少，同時，SFRP2啟動子發生了超甲基化，通過激活WNT通路，增加了口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖能力。Yamamura等[15]在體外和體內研究中發現，減少腎腫瘤細胞的SFRP2表達可以明顯促進腫瘤的生長；相反，穩定過表達SFRP2可以通過增加細胞G2期階段的比例，抑制腫瘤的生長、誘導細胞產生凋亡。研究人員還發現，穩定過表達SFRP2的細胞系中，磷酸化β-catenin水平升高。同時可觀察到c-fos，Bcl-2，Bcl-w、cyclin B2及細胞周期蛋白E2基因的表達增加與p53的表達下降；SFRP2激活WNT通路而引起的不同信號轉導通路的改變，促進了腎癌細胞的生長。可見SFRP2可從多個角度，調控多種腫瘤的WNT通路活性，在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用。

目前SFRP2對宮頸癌細胞增殖的影響鮮見報道，為了初步探討SFRP2在宮頸癌發生、發展中可能的重要作用，本研究用臨床標本，檢測了SFRP2的表達，發現在宮頸癌組織中SFRP2呈低表達狀態；提示SFRP2異常表達很可能為促癌因子，參與宮頸癌的發生、發展過程。隨后作者在體外部分的研究發現，通過CCK-8和平板克隆形成實驗發現過表達SFRP2可以抑制宮頸癌的增殖能力，且SFRP2的這種效應與抑制WNT信號通路及其下游靶基因c-myc和Cyclin D1等基因和蛋白的表達水平密切相關。

綜上所述，本研究首次發現了SFRP2參與宮頸癌發生、發展的可能機制，同時也加深了作者對SFRP2蛋白參與調控腫瘤生物學行為的認識，并為宮頸癌的診斷提供了方向，也為治療宮頸癌新藥的作用靶點提供了新的實驗證據，值得進一步深入研究。

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Study on inhibition role of SFRP2 on cervical cancer cell line proliferation

LanJian，LiuXiaoyun△，LiuHonglan

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,ZunyiMunicipalFirstPeople′sHospital,Zunyi,Guizhou563002,China)

[Abstract] Objective To understand the expression change of SFRP2 in human cervical cancer tissue and to investigate the effect of SFRP2 on cervical cancer cell proliferation.Methods The expression of SFRP2 in cervical cancer tissue was detected by using Western blot and qRT-PCR;the SFRP overexpressed human cervical cancer line was constructed by using lentivirus,the effect of SFRP2 on the proliferation of human cervical cancer cell line was analyzed by CCK-8 and plate cloning.The effect of SFRP2 on the expression of WNT pathway related proteins and genes in human cervical cancer cell was detected by Western Bolt and qRT-PCR.Results Compared with paracancerous tissue,SFRP2 was lowly expressed in human cervical cancer tissue;overexpressed SFRP2 cervical cancer cell proliferation was inhibited;SFRP2 inhibiting cellular proliferation was occurred via WNT signal pathway.Conclusion The role of SFRP2 as a candidate gene for cervical cancer remains to be deeply studied.

SFRP2；uterine cervical neoplasms；proliferation；WNT signaling pathway

蘭健(1972-)，副主任醫師，本科，主要從事婦科腫瘤的診治研究。△

，E-mail:656479556@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.008

R246.3；R737.33；R73-3

A

1671-8348(2017)09-1179-03

2016-08-14

2016-11-28)

論著·基礎研究