miRNA-204靶向LC3B在AngⅡ誘導的心肌肥厚中的作用

黃炯華，戴文軍，林育輝，伍金雷，謝文杰，陳永權

(廣州醫科大學附屬第三醫院心血管內科 510150)

miRNA-204靶向LC3B在AngⅡ誘導的心肌肥厚中的作用

黃炯華，戴文軍，林育輝，伍金雷，謝文杰，陳永權

(廣州醫科大學附屬第三醫院心血管內科 510150)

[摘要] 目的 探討體外血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導原代大鼠心肌細胞肥大中miRNA-204靶向自噬微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)表達的作用。方法 以原代大鼠心肌細胞為研究對象，根據不同的處理分為對照組、AngⅡ組、聯合1組(心肌細胞給予人AngⅡ刺激同時感染陰性對照慢病毒載體)和聯合2組(心肌細胞給予人AngⅡ刺激同時感染miRNA-204慢病毒過表達載體)。各組在干預治療后48～72 h，行激光共聚焦檢測心肌細胞肥大變化，熒光定量PCR探測miRNA-204的表達,蛋白印跡測定LC3B的表達；同時，雙熒光素酶活性基因報告驗證miRNA-204的靶基因。結果 與對照組比較，AngⅡ組心肌細胞相對表面積明顯增大，同時LC3B蛋白表達明顯升高、miRNA-204表達上調，差異均有統計學意義(P<0.05)。與聯合1組比較，聯合2組能明顯減少LC3B蛋白表達，同時使心肌細胞相對表面積縮小(P<0.05)。進一步的熒光素酶活性報告基因實驗結果提示，miRNA-204能結合LC3B的非翻譯區的野生型片段減少熒光素霉活性(P<0.05)；但不能結合其突變型片段滅活熒光素酶活性(P>0.05)。結論 miRNA-204能抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用是通過靶向LC3B的表達實現的。

微RNA-204；心肌肥厚；血管緊張素Ⅱ；原代大鼠心肌細胞

心臟在各種壓力(如壓力負荷、體內神經體液因子等)刺激下，促進心臟代償性心肌肥厚，最終會進展成為心力衰竭。既往研究表明，左心室肥厚是心腦血管事件的獨立危險因素[1]。為此，探索抑制心臟肥厚的新機制有望為心力衰竭的防治提供重要的線索。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)在壓力負荷誘導心臟肥厚的發生、發展及維持中有著至關重要的作用。有研究表明，微RNA(microRNA，miRNA)是生物體內源的非編碼RNA，其通過結合基因非編碼區域的互補片段(3′-URT)來分解或抑制基因轉錄表達[2]。此外，壓力負荷誘導的大鼠心臟肥厚的心臟組織miRNA基因芯片測定表明，miRNA-204表達下調[3]；而作者前期研究發現，壓力負荷誘導的心臟肥厚其心肌組織中存在自噬微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)表達上調[4]，體外AngⅡ誘導的原代大鼠心肌細胞肥大中，LC3B表達結果與體內一致[5]。通過網絡基因信息軟件targetscan預測，LC3B是miRNA-204的靶基因。然而，miRNA-204在心肌細胞中，是否靶向作用LC3B的表達及其對AngⅡ誘導的心肌肥厚是否有調控作用尚不明確。本研究以AngⅡ誘導原代大鼠心肌細胞肥大為模型，探討miRNA-204靶向LC3B表達在心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：1～3 d的SD乳鼠由廣州醫科大學實驗動物中心提供，體質量5～10 g。(2)試劑及儀器：E.Z.N.ATM Blood DNA Kit反應試劑盒購自美國Omega公司；pGL3熒光報告質粒及內對照質粒pRL-TK購自invitrogen公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；Alexa Fluor555 Phalloidin購自美國Invitrogen公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit購自日本Takara公司；定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit購自日本Takara公司；NP-40裂解液購自上海Beyotime公司；單克隆抗體LC3B購自Cell Signaling Technology公司；單克隆抗體GAPDH購自Epitomics公司；免疫二抗體購自武漢BOIWORLD公司；曝光液購自上海Beyotime公司；陰性對照慢病毒載體、miRNA-204慢病毒過表達載體由上海吉瑪公司構建；Zeiss LSM 710的激光共聚焦儀購自德國公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶LC3B非編譯區域野生型片段和突變型片段質粒構建 通過E.Z.N.ATM Blood DNA Kit反應試劑盒的操作方法從大鼠血樣品中獲取基因組DNA。大鼠LC3B 3′-URT野生型片段和突變型片段通過融合PCR方法從大鼠基因組DNA中獲取，同時予ECOR I和Xba Ⅰ酶切野生型片段、突變型片段和pGL3熒光報告載體，用連接酶連接構建獲得相應質粒，分別命名為pGL3-LC3B 3′-URT-Wild Type 和pGL3-LC3B 3′-URT-Mutant。

1.2.2 細胞培養和治療分組 原代大鼠心肌細胞通過胰酶消化出生1～3 d的SD乳鼠心臟獲取，參照文獻[6]報道進行培養。根據不同的處理分成4組：對照組(心肌細胞未予特殊處理)、AngⅡ組(心肌細胞給予1 μmol/L AngⅡ刺激)、聯合1組(心肌細胞給予AngⅡ刺激同時感染陰性對照慢病毒載體)、聯合2組(心肌細胞給予AngⅡ刺激同時感染miRNA-204慢病毒過表達載體)。慢病毒感染心肌細胞以4×105心肌細胞數加進20 μL病毒液和凝聚胺使得其終濃度為5 μg/mL。而pGL3攜帶LC3B 3′-URT-Wild Typy或 3′-URT-Mutant質粒及內對照質粒pRL-TK轉染心肌細胞時則根據Lipofectamine LTX and PLUS Reagents試劑盒說明書進行。

1.2.3 激光共聚焦檢測 心肌細胞收集后用3.7%多聚乙醛在常溫下孵育，并用PBS-T稀釋的1% Trion X進行孵育15 min破膜。然后，心肌細胞用Alexa Fluor555 Phalloidin(按1∶35稀釋)孵育25 min進行染色；最后，再加入濃度為300 nmol/L的DAPI溶液進行復染色5 min。心肌細胞圖像通過Zeiss LSM 710的激光共聚焦儀獲取。每個樣品獲取5個不同視野的圖片，并通過Image-Pro Plus 6.0 軟件計算平均細胞表面積，處理各組分別與對照組的平均心肌細胞表面積進行比較獲取倍數值后進行統計分析。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈(qRT-PCR)檢測 心肌細胞總RNA通過Trizol獲取，cDNA則根據試劑盒PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit說明書操作方法獲得。同時，定量PCR根據試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit操作說明在購自瑞士Roche公司的熒光定量PCR儀進行測定。U6作為miRNA-204的內對照，相對表達水平通過計算2-△△CT方法獲取。其相關引物序列如下，U6逆轉錄引物序列：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′；熒光定量PCI引物序列上游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′，下游：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′。miRNA-204逆轉錄引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC AGG CAT AG-3′；熒光定量PCI引物序列上游：5′-GCC CTT CCC TTT GTC ATC-3′，下游：5-′CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。

1.2.5 細胞蛋白抽提和蛋白印跡檢測 心肌細胞收集后采用NP-40裂解液進行抽提，蛋白濃度通過BCA法測定。約取樣品40 μg蛋白進行電泳分離和轉膜。將承載有目的蛋白膜用5%脫脂奶粉進行封閉1 h，然后加入單克隆抗體LC3B和單克隆抗體GAPDH于4 ℃孵育過夜。孵育過夜的蛋白膜用PBS-T液洗滌后，加入免疫二抗體進行孵育免疫共沉淀反應。免疫復合物通過曝光液進行曝光獲取底片。LC3B蛋白表達量用內對照蛋白GAPDH標準化后計算獲得。

1.2.6 雙熒光素酶活性基因報告測定 為了更好地評價miRNA-204是否調控LC3B的表達，作者進行雙熒光素酶基因報告測定。心肌細胞以每孔5×104數量種植到24孔板中進行培養。(1)將miRNA-204模擬物和對照物、miRNA-204抑制物和對照物通過試劑盒Lipofectamine?RNAiMAX Reagent在心肌細胞進行轉染12 h；(2)根據Lipofectamine LTX and PLUS Reagents試劑盒說明書進行操作，同時將3′-URT-Wild Typy或 3′-URT-Mutant質粒及內對照質粒pRL-TK共轉染進心肌細胞并孵育48 h；(3)將心肌細胞收集，在Lumat LB9507熒光細胞收集儀測定海腎素酶和螢火素酶的活性。通過內對照載體pRL-TK提供海腎素霉活性的表達來標準化螢火素霉活性的表達量。

2 結 果

2.1 對照組與AngⅡ組心肌細胞表面積比較 濃度為1 μmol/L的AngⅡ刺激心肌細胞48 h，心肌細胞表面積較對照組明顯增大，通過Image-Pro Plus 6.0 測定平均細胞表面積進行比較，AngⅡ組平均細胞表面積較對照組增多，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A：對照組；B：Ang Ⅱ組；C：兩組細胞表面積比較；a：P<0.05，與對照組比較。

a：P<0.05，與對照組比較。

A：聯合1組；B：聯合2組；C：兩組蛋白印跡檢測；D：兩組細胞LC3B表達比較；a：P<0.05，與聯合1組比較。

表1 雙熒光素酶活性分析miRNA-204靶向LC3B的相對表達量

a：P<0.05，與miRNA對照組比較；b：P<0.05，與siRNA對照組比較。

2.2 對照組與AngⅡ組肥大心肌細胞中miRNA-204和LC3B表達水平比較 心肌細胞予AngⅡ 刺激48 h后行miRNA-204及LC3B蛋白表達測定，與對照組比較，AngⅡ組miRNA-204表達下調，而LC3B蛋白表達上調，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 聯合1、2組心肌細胞表面積和LC3B表達比較 在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中，通過慢病毒轉染心肌細胞過表達miRNA-204，觀察其對心肌細胞肥大及LC3B表達的作用。結果顯示，聯合1組相對細胞表面積為1.82±0.10，聯合2組為1.04±0.07，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05);與聯合1組比較，聯合2組LC3B表達下調(P<0.05)，見圖3。

2.4 LC3B是miRNA-204的靶向基因 當心肌細胞轉染LC3B 3′-URT野生型載體后，同時轉染miRNA-204模擬物和對照物、miRNA-204抑制物和對照物時，轉染模擬物較對照物的熒光素霉活性下調(P<0.05)；轉染抑制物較對照物比較熒光素霉活性上調(P<0.05)。然而，當心肌細胞轉染LC3B 3′-URT突變型載體后，同時轉染miRNA-204模擬物和對照物、miRNA-204抑制物和對照物時，其與各自的對照物比較熒光素霉活性變化均差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

3 討 論

AngⅡ作為重要的神經體液因子，是心肌肥厚作用的重要啟動子[7]。本研究通過AngⅡ刺激原代大鼠心肌細胞構建體外心肌細胞肥大模型。本研究結果表明，AngⅡ刺激的心肌細胞肥大中，存在miRNA-204表達下調和LC3B蛋白表達增高；同時，通過慢病毒載體感染心肌細胞過表達miRNA-204可抑制AngⅡ誘導的LC3B蛋白表達和心肌細胞肥大加劇；最后，通過雙熒光素酶基因報告測定證實LC3B是miRNA-204的靶向基因。因此，實驗結果進一步證實，miRNA-204靶向LC3B的表達來抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。

miRNA-204的表達水平在不同的疾病狀態各有差異。在衰老相關的海馬神經組織表達上調[8]，然而在一些腫瘤相關的疾病，如腎細胞癌[9]和前列腺癌細胞[10]中其表達明顯下調。關于miRNA-204在心血管疾病方面的研究表明，在心肌細胞缺血再灌注損傷中其表達下調[11]；同時在β-甘油誘導的動脈鈣化中，動脈平滑肌細胞的miRNA-204表達下調，過表達miRNA-204可抑制平滑肌細胞向成骨細胞分化進而減輕血管鈣化[12]。既往壓力負荷誘導心臟肥厚的心肌組織發現miRNA-204表達下調[3]，本研究在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中，也發現其表達下調。然而，其在心肌肥厚的確切作用仍不明確。事實上，miRNA-204與其他miRNA一樣，可以通過結合不同的目的基因的非編碼區域的互補片段進而在基因轉錄水平上調控其表達參與疾病的發生和發展。如miRNA-204調控Runx2蛋白的表達參與調控平滑肌細胞向成骨細胞分化[12]；miRNA-204抑制食管癌細胞FOXM1基因的表達，進而抑制其侵襲及上皮-間質轉化[13]。本研究體外實驗發現，AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中，LC3B基因表達上調；通過慢病毒感染心肌細胞過表達miRNA-204可以抑制LC3B蛋白的表達，同時減輕AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。進一步的雙熒光素酶基因報告檢測證實，miRNA-204可結合LC3B基因的3′-URT片段，抑制其表達。本研究結果表明，miRNA-204可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用可能是通過靶向LC3B基因表達而實現。

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Role of miRNA-204 targeted LC3B in AngⅡ induced myocardial hypertrophy

HuangJionghua，DaiWenjun，LinYuhui，WuJinlei，XieWenjie，ChenYongquan

(DepartmentofCardiology,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

[Abstract] Objective To explore the effects of miRNA-204 targeted LC3B expression on AngⅡinduced cardiomyocytes hypertrophy.Methods The primary neonatal rat cardiomyocytes served as the research objects and divided into the control group,AngⅡ group,combination-treated group 1 (cardiomyocytes were given AngⅡstimulation,meanwhile infected by negative control lentivirus vector),combination-treated group 2 (cardiomyocytes were given AngⅡstimulation,meanwhile infected by lentivirus carrying miRNA-204 overexpression vector) according to different treatments.About 48 h to 72 h after intervention treatment,the cardiomyocyte hypertrophy change was detected by confocal microscopy,the expression of miRNA-204 was analyzed by real time PCR,the protein expression of LC3B was measured by Western blot and targeted gene of miRNA-204 was demonstrated by dual-luciferase reporter assay system.Results Compared with the control group,the cardiomyocyte relative surface area in the AngⅡ group was significantly enlarged,the protein expression of LC3B was significantly increased,the expression of miRNA-204 was up-regulated,the differences were statistically significant (P<0.05).Whereas comparing the combination-treated group 1 with combination-treated group 2,the protein expression of LC3B in the latter was down-regulated and the cell area was reduced (P<0.05).The further luciferase activity report gene experiment results suggested that miRNA-204 was able to bind to LC3B 3′-UTR and decreased the luciferase activities (P<0.05),but not to bind its mutated fragment for inactivating luciferase activity(P>0.05).Conclusion miRNA-204 is able to inhibit AngⅡinduced cardiomyocytes hypertrophy,its action is realized by targeting the expression of LC3B.

microRNA-204;myocardial hypertrophy;angiotensinⅡ;neonatal rat cardiomyocytes

黃炯華(1984-)，主治醫師，博士，主要從事心肌肥厚的基礎及臨床研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.007

R541.3

A

1671-8348(2017)09-1175-04

2016-08-24

2016-11-07)

論著·基礎研究