靜脈注射全氟化碳預處理與后處理對急性肺損傷大鼠的影響

尹曉峰，錢國強△，樊毫軍,宋建奇

(1.黃淮學院護理學院,河南駐馬店 463000；2.武警醫學院附屬醫院醫教部,天津 300162)

論著·基礎研究

靜脈注射全氟化碳預處理與后處理對急性肺損傷大鼠的影響

尹曉峰1，錢國強1△，樊毫軍2,宋建奇2

(1.黃淮學院護理學院,河南駐馬店 463000；2.武警醫學院附屬醫院醫教部,天津 300162)

目的 探討靜脈注射全氟化碳(PFC)預處理與后處理對脂多糖(LPS)致急性肺損傷大鼠的保護作用及相關作用機制。方法 選取24只雄性Wistar大鼠分為對照組(NS組)、LPS組、PFC預處理組(Pre組)和PFC后處理組(Post組)。NS組均以等量生理鹽水作對照，LPS組經氣管內滴注LPS；Pre組于氣管內滴注LPS前經股靜脈注射PFC； Post組于氣管內滴注LPS后經股靜脈注射PFC。NS組于氣管內滴注生理鹽水后6 h，LPS組、Pre組與Post組分別于滴注LPS后6 h處死動物。比較各組大鼠肺病理學變化，PaO2，肺濕干比(W/D)，肺髓過氧化物酶(MPO)及細胞黏附分子-1(ICAM-1)表達情況。結果 應用PFC明顯升高PaO2，降低肺W/D比值、MPO活性及ICAM-1表達水平(P<0.05)，而且Pre組較Post組作用更顯著。結論 靜脈注射PFC對ALI具有保護作用，以PFC預處理效果更為顯著，其機制可能與下調ICAM-1表達有關。

呼吸窘迫綜合征，成人；脂多糖；全氟化碳；細胞黏附分子-1；中性粒細胞

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS) 是由嚴重感染、創傷、休克、中毒及吸入有害氣體等各種致病因素導致的急性呼吸功能不全或衰竭，臨床以呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征，是臨床常見的急危重癥，病死率極高。其發病機制迄今尚未完全闡明，目前普遍認為肺內過度失控性炎癥反應，炎性介質和抗炎介質二者失衡，最終引起不可逆性病變是導致ALI/ARDS發生的根本原因[1-2]。因此，積極尋找抑制炎癥反應，減輕病理損傷的方法是治療ALI/ARDS的關鍵所在。研究表明，全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)具有的理化特性能夠提高肺順應性，改善ALI動物模型的氧合功能和呼吸力學指標[3]。但是目前關于PFC在ALI的應用研究主要是通過采用部分液體通氣技術，需要建立人工氣道，不便對早期尚未插管的患者進行干預。鑒于此，本研究考慮對ALI大鼠損傷前后進行靜脈滴注PFC途徑給藥，觀察其對PMN浸潤及病理損傷的影響，并對作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠24只，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，體質量180～220 g。實驗試劑：PFC(北京天水生物科技公司)；脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠抗大鼠細胞黏附分子-1(ICAM-1)單克隆抗體(美國Abcam公司)；免疫組織化學染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及實驗分組 24只健康雄性Wistar大鼠分為4組：(1)對照組(NS組)，給予等體積生理鹽水作對照。(2)脂多糖組(LPS組)，大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，將動物取仰臥位固定于實驗臺上，逐層暴露氣管，以0.5 mL/kg LPS溶液進行氣管內滴注，藥物注入完畢將大鼠取直立位并旋轉，便于藥液均勻分布。(3)PFC預處理組(Pre組)，于氣道滴注LPS前30 min經股靜脈注射PFC(6 mL/kg)。(4)PFC后處理組(Post組)，于氣道滴注LPS后30 min經股靜脈注射PFC(6 mL/kg)。

表1 各組PaO2、W/D、MPO、ICAM-1比較

*:P<0.05，與NS組比較；#:P<0.05，與LPS組比較；▲:P<0.05，與Pre比較。

A：NS組；B：LPS組；C：Pre組；D：Post組。

圖1 各組肺組織病理學變化(×400)

A：NS組；B：LPS組；C：Pre組；D：Post組。

圖3 各組肺組織ICAM-1的表達(×400)

1.2.2 標本采集與檢測 滴注LPS或NS后6 h取腹主動脈血行血氣分析并放血處死動物，開胸取全部左肺，濾紙吸干表明水分和血液，稱取濕質量(W)，置80 ℃干燥箱烘烤48 h，稱取干質量(D)，計算肺濕干比(W/D)；取右肺上葉和中葉用10%乙醇溶液固定，常規石蠟包埋切片，用于HE染色及免疫組織化學分析肺組織ICAM-1的表達情況；取右肺下葉置于離心管，并放于低溫冰箱中保存，采用比色法測定肺組織MPO活性，具體操作步驟嚴格按照說明書步驟進行。

1.2.3 肺組織ICAM-1表達的判定標準 采用Image-proplus醫學圖像分析系統處理，以光密度平均值代表ICAM-1的表達強度。

2 結 果

2.1 動脈血氧分壓(PaO2)比較 與NS組比較，LPS組PaO2顯著降低(P<0.05)，PFC可顯著提高ALI大鼠PaO2，但仍低于NS組(P<0.05)，并且Pre組較Post組對PaO2提升作用更明顯(P<0.05)，見表1。

2.2 肺W/D變化 LPS組較NS組大鼠肺W/D明顯增加(P<0.05)，PFC可明顯降低ALI大鼠肺W/D，并且Pre組比Post組大鼠肺W/D更低(P<0.05)，見表1。

2.3 肺組織病理學觀察 與NS組大鼠肺組織比較，LPS組光鏡下可見肺組織結構破壞明顯，肺泡毛細血管擴張充血，肺泡壁破裂，間隔增寬，大量PMN等炎癥細胞浸潤，伴出血及肺間質水腫；應用PFC減輕ALI大鼠肺組織病理損傷程度，光鏡下可見肺間隔輕度增寬、無明顯出血，少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.4 肺組織MPO活性的比較 與NS組比較，LPS組大鼠肺組織MPO活性顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，Pre組和Post組MPO活性明顯降低(P<0.05)，并且Pre組比Post組大鼠肺MPO活性更低(P<0.05)。見表1。

2.5 肺組織ICAM-1的表達 NS組ICAM-1未見明顯表達；LPS組則表達明顯增多，可見血管內皮細胞、支氣管上皮細胞及肺泡上皮細胞有棕黃色或深棕色顆粒，染色較深；Pre組和和Post組表達相對減少，染色較淺(圖2)。圖像分析結果表明，與NS組比較，LPS組ICAM-1光密度平均值明顯增高(P<0.05)。Pre組和和Post組與LPS組比較ICAM-1光密度平均值顯著降低(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)，并且Pre組比Post組大鼠肺ICAM-1光密度平均值更低(P<0.05)。

3 討 論

近年來，大量研究表明以PFC作為通氣媒介的部分液體通氣技術在治療ALI/ARDS上取得了理想的效果，可顯著改善ALI動物的氧合功能和肺順應性，穩定血流動力學狀態，減輕肺損傷，降低實驗動物的病死率，并且無明顯不良影響[4-7]。然而，這些措施需要建立人工氣道以便于PFC進入肺部發揮作用，因而并不適用于早期尚未插管患者的治療。因此，在本實驗選擇了靜脈注射方式給予PFC乳液，觀察和評價其對ALI大鼠的影響，并在大鼠造模前后分別給予同等劑量的PFC，觀察比較二者對ALI大鼠相應指標的影響，旨在評價不同時點靜脈注射PFC對ALI大鼠的效果。

本實驗表明，對LPS誘導的ALI大鼠采取靜脈注射給予PFC能夠明顯改善ALI大鼠的肺功能，提高PaO2，降低肺W/D，減輕肺水腫，減輕肺組織病理損傷，其可能和PFC抑制ICAM-1表達，減少PMN肺組織浸潤有關。這些結果提示PFC對于ALI患者，尤其是早期患者可能具有一定的臨床應用價值。

ALI/ARDS是一種由多種致病因素引發的全身炎癥反應和自身代償抗炎反應失調，從而損傷器官，肺臟往往成為所累及的首位靶器官[8]。目前，ALI/ARDS的發病機制尚未完全闡明，有待進一步深入研究。其中，PMN在肺內聚集、激活，并釋放蛋白酶、氧自由基和炎性介質等，以及其他炎癥細胞的參與在ALI/ARDS的發病起著重要的作用[5]。正常情況下ICAM-1表達有著嚴格的調控機制,在LPS等刺激因素的作用下,毛細血管內皮細胞上ICAM-1表達上調，PMN與毛細血管內皮細胞之間的黏附作用增強,進而大量聚集，游出肺血管床，進入肺泡腔，促進炎癥的發生、發展，造成肺組織損傷[9]。

目前，關于PFC在ALI的應用研究主要是通過采用部分液體通氣技術及汽化吸入，而對靜脈注射給藥途徑研究較少。大量研究表明，應用PFC對于ALI/ARDS具有保護意義，但保護作用機制尚有待研究。PFC 是一類碳氫化合物中的氫原子被氟原子取代后形成的化合物，它可以在呼吸道內發揮良好的氣體轉運功能。大量研究表明，PFC具有廣泛的非特異性抗炎效應，能夠明顯減少炎癥細胞的趨化、聚集和浸潤，并能抑制炎性介質的釋放，對ALI具有重要的保護作用，PFC的非特異性抗炎效應可能是其對于ALI重要的保護機制之一。Rüdiger等[10]研究發現，PFC能夠促進肺泡表面活性物質的分泌，降低肺泡表面張力，減少肺不張，有利于肺通氣。Nakata等[11]研究發現，循環系統內的PFC乳劑能夠通過彌散作用到達肺血管內皮細胞、肺泡上皮細胞等，作為一個物理屏障阻擋炎癥細胞、炎性介質等對肺組織的損害，進而發揮其保護作用。本實驗研究結果表明，PFC明顯提高PaO2,降低肺組織MPO活力，減輕PMN的肺內浸潤程度，減輕LPS致ALI大鼠肺損傷程度。在LPS刺激下,肺組織ICAM-1表達明顯增高，PMN與血管內皮細胞黏附、游走與滲出，向炎癥部位積聚，加強炎癥反應，造成肺組織損傷持續加重。本研究結果提示,PFC可明顯下調LPS致ALI時ICAM-1在肺組織的表達,減輕肺組織炎癥反應，提示PFC可能通過下調ICAM-1，減少PMN浸潤，減輕炎癥反應對ALI大鼠發揮保護作用。

本研究通過對ALI大鼠造模前后進行靜脈注射PFC并進行比較發現LPS行氣道滴注前應用PFC相較LPS行氣道滴注后應用PFC能夠更有效的提高PaO2,減少肺組織ICAM-1表達，降低PMN肺組織浸潤，減輕肺組織病理損傷，對于ALI大鼠具有更強的保護作用，該結果出現的原因可能與應用PFC進行預處理時能夠使其在LPS進入肺內之前覆蓋于肺泡表面，更好地發揮其屏障保護作用，從而顯著降低了LPS對肺組織的損傷作用；而PFC后處理組則由于應用LPS在前，使得肺組織損傷提早形成，再應用PFC僅能起到一定的治療效果。

綜上所述，靜脈注射PFC對ALI具有保護作用，該給藥途徑不需要建立人工氣道，更適用于早期ALI，并且PFC預處理和后處理兩種給藥時點比較，預處理對于ALI肺功能改善，肺組織病理損傷減輕效果更顯著，而且通過本研究表明PFC的保護作用機制可能與PFC下調ICAM-1表達，進而減少PMN肺組織浸潤有關，這也為臨床靜脈注射PFC防治ALI/ARDS提供了理論基礎。

[1]唐瑾，郭忠良.全氟化碳在治療ALI/ARDS時對促炎因子影響的研究進展[J].同濟大學學報(醫學版)，2014，35(4)：129-132.

[2]連祥基，喻文強，余革，等.低劑量全氟化碳不同時點干預急性肺損傷實驗兔對肺組織病理學的影響[J].廣東醫學，2015，36(17)：2669-2672.

[3]Guo ZL,Lu GP,Ren T,et al.Partial liquid ventilation confers protection against acute lung injury induced by endotoxin in juvenile piglets[J].Respir Physiol Neurobiol,2009,167(3):221-226.

[4]Rimensberger PC.Partial liquid ventilation:is it really time to give it a go?[J].Pediatr Crit Care Med,2008,9(6):664-666.

[5]余革，劉瑾，溫曉暉，等.全氟化碳汽化吸入預處理對急性肺損傷實驗兔早期炎癥因子的影響[J].新醫學，2011，42(8)：513-517.

[6]Wang X,Zhang J,Li X,et al.Sustained improvement of gas exchange and lung mechanics by vaporized perfluorocarbon inhalation in Piglet acute lung injury model[J].Clin Respir J,2014,8(2):160-166.

[7]Shashikant BN,Miller TL,Jeng MJ,et al.Differential impact of perfluorochemical physical properties on the physiologic,histologic,and inflammatory profile in acute lung injury[J].Crit Care Med,2005,33(5):1096-1103.

[8]Everhart MB,Han W,Sherrill TP,et al.Duration and intensity of NF-kappaB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury[J].J Immunol,2006,176(8):4995-5005.

[9]芮萌，段蘊鈾.中性粒細胞凋亡與急性肺肺損傷[J].中國急救醫學，2008，28(12)：1129-1132.

[10]Rüdiger M,Wissel H,Ochs M,et al.Perfluorocarbons are taken up by isolated type Ⅱ pneumocytes and influence its lipid synthesis and secretion[J].Crit Care Med,2003,31(4):1190-1196.

[11]Nakata S,Yasui K,Nakamura T,et al.Perfluorocarbon suppresses lipopolysaccharide and alpha-toxin-induced interleukin-8 release from alveolar epithelial cells[J].Neonatology,2007,91(2):127-133.

Effect of intravenous infusion with perfluorocarbons pretreatment and posttreatment on acute lung injury in rats

YinXiaofeng1,QianGuoqiang1△,FanHaojun2,SongJianqi2

(1.DepartmentofNursing,HuanghuaiCollege,Zhumadian,Henan463000,China;2.DepartmentofMedicalEducation,theAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Objective To investigate the protective effect and the possible mechanism of intravenous infusion with perfluorocarbon pretreatment and posttreatment on acute lung injury in rats on LPS-induced acute lung injury in rats.Methods A total of 24 Wistar rats were randomly divided into 4 groups:control group(NS group),LPS group,Pre group and Post group.Normal saline was given to NS group as a control.Rats were treated with LPS by intratracheal instillation in LPS group,rats received PFC through femoral vein prior to LPS instillation in Pre group and rats received PFC through femoral vein after LPS instillation in Post group.NS group were sacrificed at 6 h after being injected with NS,LPS group,Pre group and Post group were sacrificed at 6h after being given LPS.Pathological changes of lung,PaO2,lung wet to dry weight ratio(W/D),expression of myeloperoxidase (MPO) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) of lung were assessed.Results Intravenous infusion with perfluorocarbons increased PaO2,decreased W/D,MPO and ICAM-1 significantly (P<0.05),and this effect is more remarkable in Pre group.Conclusion Intravenous infusion of PFC significantly protects lung from acute lung injury,especially by pretreatment forms,probably by down-regulate the expression of ICAM-1.

respiratory distress syndrome,adult;lipopolysaccharide;perfluorocarbon;intercellular adhesion molecule-1;polymorphonucleral neutrophil

尹曉峰(1982-)，講師，碩士，主要從事病理生理學研究。△

，E-mail:gqqian1@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.005

R361.2

A

1671-8348(2017)08-1020-03

2016-09-21

2016-11-16)